斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因的扩增、测序和cytb基因在斯氏狸殖吸虫不同虫期的表达

发布时间：2018-04-19 05:07

  本文选题：斯氏狸殖吸虫 + 线粒体基因　； 参考：《泸州医学院》2012年硕士论文

【摘要】：目的：扩增出斯氏狸殖吸虫线粒体Cytb (cytochrome B)基因片段并测序,研究斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因在囊蚴期、30天幼虫期、60天童虫期、成虫期和虫卵期5个虫期的表达情况,分析该基因对吸虫遗传分类、虫期物质代谢及致病方面的意义。方法：(1)提取斯氏狸殖吸虫成虫基因组DNA,同时分别提取斯氏狸殖吸虫5个虫期的mRNA,并反转录为cDNA。基因组DNA和各虫期cDNA保存于-20℃。(2)用日本血吸虫线粒体cytb基因设计出斯氏狸殖吸虫的线粒体cytb基因的兼并引物,扩增出虫体囊蚴的总DNA,聚合酶链式反应(PCR)法扩增出斯氏狸殖吸虫cytb基因片段→电泳分离→提纯→连接→转化→挑菌→摇菌→送出测序。用所得的测序结果设计斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因片段的特异引物。(3) Blast与斯氏狸殖吸虫cytb有亲缘性的吸虫,并用DNAsis等软件分析这些吸虫的线粒体cytb基因,然后用树的方式表达它们的亲缘关系。(4)以5个虫期的cDNA为模板,特异引物为实验组引物,卫氏狸殖吸虫的18SrDNA基因引物作为内参引物做实时荧光定量PCR (realtime PCR)。根据所获得的结果判断斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因分别在5个虫期的表达情况并分析其意义。结果：(1)获得542bp的斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因片段,并将该基因片段纳入NCBI基因库中。根据该基因片段设计出一对斯氏狸殖吸虫线粒体cytb基因片段的特异引物CytbF:5'GGTTGCTTGATCATAACATTGG3'CytbR:5GACACTCTGGGTCGACCTTG5'(2)通过在Genebank数据库中Blast发现,斯氏狸殖吸虫的此段cytb序列与日本血吸虫(中国流行区虫种)、异盘并殖吸虫、哈氏并殖吸虫、卫氏并殖吸虫以及斜睾吸虫等有相似性,一共搜索到种7种具有同源性的虫种,对这7种吸虫线粒体cytb序列利用MEGA4计算遗传距离,采用最大简约法(MP)和邻位相连法(NJ)构建系统进化树,Bootstrap法检验,并用Clusterx软件对7种吸虫线粒体cytb序列进行多序列对比。结果显示,用NJ和MP方法构建的遗传系统进化树拓扑结构相似,同时用MEGA4软件对遗传距离进行分析计算上,所得遗传距离远近分布与所得遗传系统进化树结果一致。(3) Realtime PCR结果显示除了虫卵期不见线粒体cytb基因的表达,其他虫期均有表达。结论：1.线粒体cytb基因可作为吸虫遗传进化分类的依据。2.线粒体cytb基因在斯氏狸殖吸虫不同虫期的表达情况与不同时期该虫对宿主的侵袭危害是成正相关的,也为以后的预防,诊断,治疗提供理论依据。
[Abstract]:Objective: to amplify and sequence the mitochondrial Cytb gene of paragonimus skrjabini, and study the expression of mitochondrial cytb gene of P. skrjabini in 5 stages of larval stage, adult stage and egg stage of P. skrjabini in 30 days larval stage, 60 days larval stage, and 5 stages of egg stage.The significance of the gene in genetic classification, substance metabolism and pathogenicity of trematodes was analyzed.Methods Genomic DNA was extracted from adult P. skrjabini and mRNAs from 5 stages of paragonimus skrjabini were extracted and reversely transcribed as cDNA.Genomic DNA and cDNA were stored at -20 鈩，

本文编号：1771688