Peyer小结中滤泡辅助性T细胞诱导B细胞分化成分泌IgA的浆细胞参与IgA肾病发病

发布时间：2018-04-28 04:53

  本文选题：IgA肾病 + Peyer小结　； 参考：《华中科技大学》2012年博士论文

【摘要】：第一部分IgAN动物模型的制备、鉴定及免疫组化 目的用黏膜免疫诱导法构建IgAN动物模型,以此模型为基础,探讨IgAN的发病机制及Peyer小结在IgAN中的作用。方法雄性BALB/C小鼠,给予牛血.清白蛋白、注射葡萄球菌肠毒索B诱导IgAN模型。第0周、6周、12周分别用代谢笼收集24小时尿液测定24小时尿蛋白,并尿沉渣红细胞计数。12周去眼球收集血清,测定血清总蛋白(TO))、白蛋白(A1b)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cvs C);肾组织IgA免疫荧光：肾组织HE、PAS及DAB染色：Peyer小结IgA、Bcl-6免疫组化。结果(1)IgAN组和Control组第0w、6w、12w 24h尿蛋白定量分别为(0.61±0.26)mg vs (0.67±0.22)mg.(3.61±0.75)mg vs (0.77±0.27)mg、(4.15±0.82)mg vs (1.09±0.51)mg,IgAN组第0w 24h尿蛋白定量与对照相比无统计学差异(P0.05),第6w、12w 24h尿蛋白定量分别高于Control组(P0.01)。IgAN组和Control组第0w、6w、12w尿沉渣红细胞计数分别为(1.90±1.20)个/HP,vs(1.30±0.95)个/HP、(1.80±0.92)个/HP vs (1.50±1.08)个/HP、(2.50±1.18)个HP vs(2.00±0.82)个/HP,IgAN组第0w、6w、12w尿沉渣红细胞计数与Control组相比均无统计学意义(P0.05)。(2)IgA免疫荧光显示IgAN组40小鼠有33只系膜区有IgA沉积,Control组40只小鼠仅有2只肾小球有少量IgA沉积,IgA沉积于肾小球系膜区,呈典型颗粒状分布。(3)与Control组相比,IgA组血清Alb降低(P0.05),Cys C升高(P0.05),TP.BUN.Cr无统计学差异(P＞0.05)。(4)Peyer小结IgA.Bcl-6免疫组化显示两者阳性细胞主要分布于生发中心亮区与暗区交界处,半定量分析显示IgAN组两者染色较Control组增强,差异有显著的统计学意义(P0.01)。结论牛血清白蛋白、葡萄球菌肠毒素联用可成功诱导IgAN模型,是较为理想的构建IgAN模型的方法,同时提示黏膜免疫可能参与了IgAN的发生。 第二部分 IgA分泌细胞在Peyer小结中的分化及Tfh细胞的调节作用 目的观察分泌IgA的B细胞在Peyer小结中的发育及分化过程,说明Peyer小结在分泌IgA的B细胞分化过程中的重要作用,以及滤泡辅助性T细胞调节B细胞分化成分泌IgA浆细胞的意义。方法在IgAN模型中,分离小肠壁上的Peyer小结,收集细胞于试管中。分管如下：①空白管(仅有细胞)；②细胞+CXCR5-APC;③细胞+CD4-PE;④细胞+CXCR5-APC+CD4-PE;⑤细胞+IgA-FITC；⑥细胞+B220-PerCP:⑦细胞+IgM-PE-Cy7；⑧细胞+IgA-FITC+B220-PerCP+IgM-PE-Cy7；⑨细胞+100ulPBS+APC-CXCR5(4u1)+PE-CD4(4u1) (IgAN)；⑩细胞+100ulPBS+ FITC-IgA(4u1)+PerCP-B220(2.Oul)+PE-Cy7-IgM(1.25u1) (IgAN).流式细胞仪测定Peyer小结中Tfh(CXCR5+CD4+)细胞、B220+IgM+B淋巴细胞、B220+IgA+B淋巴细胞、B220+IgA+浆母细胞、IgA的百分率。结果IgAN模型组和Control组Tfh细胞、B220+IgM+B淋巴细胞、B220+IgA+B淋巴细胞、B220-IgA+浆母细胞、IgA百分率分别为10.6%±2.49%vs 4.88%±1.41%、34.7%±11.1%vs 24.3%±7.84%、7.92%±2.21%vs5.75%±2.10%、5.57%±1.75%vs 3.74%±1.46%、13.5%±3.62%vs 9.49%±2.14%。IgAN组Tfh细胞和IgA白分率与对照相比有显著的统计学意义(P0.01),B220+IgM+B淋巴细胞、B220+IgA'B淋巴细胞、B220-IgA+浆母细胞分别高于Control组(P0.05)。结论在IgAN模型鼠Peyer小结中Tfh细胞百分率增加,提示Tfh细胞在介导B细胞分化成为分泌IgA的浆细胞中起调：节作用；Peyer小结B细胞发育并向分泌IgA浆母细胞生成明显占优势,是IgA浆母细胞生成的主要部位,为B细胞向分泌IgA的浆母细胞转化和IgAN发病提供了微环境。 第三部分Peyer小结中Tfh细胞功能测定 目的测定Peyer小结中抗牛血清白蛋白(抗-BSA)抗体水平，，间接反映Peyer小结Tfh细胞功能,探讨IgA肾病Peyer小结中Tfh细胞功能的改变。方法分离Peyer小结,磁珠分选Peyer小结中的CXCR5+CD4+细胞,与自体脾细胞共培养,第8天Western blot测定上清液抗-BSA含量反映Tfh细胞的功能。结果IgAN模型组和Control组细胞培养上清液抗-BSA表达水平分别为0.58±0.10 vs 0.31±0.08。IgAN组Peyer小结抗-BSA浓度较Control组升高,差异有统计学意义(t=2.97,P=0.01)。结论IgAN中,Peyer小结Tfh细胞不仅百分率增加,而且功能明显增强,进一步提示Tfh细胞在介导B细胞分化成为分泌IgA的浆细胞中起重要的调节作用。 第四部分Peyer小结中Tfh细胞相关转录因子和细胞因子的表达 目的测定Peyer小结Tfh细胞分泌因子白细胞介索-21(IL-21)和转化生长因子-β1 (TGF-β1) mRNA的表达,测定IL-21 Bcl-6, Blimp-1蛋1白质的表达。探讨Tfh细胞相关细胞因子的功能及它们在IgAN中的作用。方法分离Peyer小结,提取总RNA、合成cDNA及进行荧光定量PCR反应,测定IL-21和TGF-β1 mRNA的表达。分离Peyer小结,提取组织蛋白,Western blot测定IL-21、Bcl-6, Blimp-1蛋白质的表达。结果IgAN组和Control组IL-21和TGF-β1 mRNA相对表达值分别为1.67±0.13 vs 1.49±0.13.1、21±0.09vs1.10±0.10。IgAN组IL,-21和TGF-β1 mRNA相对表达值较Control组升高,差异分别有统计学意义(t=2.730,P=0.016；t=2.416,P=0.03)。IgA组IL-21,Bcl-6和Blimp-1(?)目对蛋白质的表达值分别为0.67±0.21,0.60±0.19和1.03±0.07；Control组IL-21,Bcl-6和Blimp-1相对蛋白质的表达值分别为0.45±0.10,0.34±0.21和0.67±0.07。IgAN组IL-21、Bcl-6和B1imp-1蛋白质相对表达值较Control组升高,差异分别有统计学意义(t=2.628,P=-0.025；t=2.665,P=-0.019；t=10.128,P=-0.000)。结论IgA肾病Peyer小结Tfh细胞相关转化因子和细胞因子表达增加,促进B细胞向分泌IgA的浆细胞分化,Peyer小结中Tfh细胞及其相关细胞因子可能参与IgA肾病的发病。 第五部分Tfh细胞相关细胞因子促进初始B细胞分化成熟并分泌半乳糖缺乏的lgA1 目的观察IgA肾病患儿初始B细胞在Tfh细胞相关因子作用下的诱导成熟过程,探讨Tfh细胞在IgAN发病机制中的作用。方法磁珠分选IgA肾病患儿外周血初始B细胞(CD27-IgD+),加IL-21和TGF-β1等细胞因子共培养,测定细胞培养上清液J链的表达、IgA分泌、半乳糖缺乏的IgAl(Gd-IgA1)水平。结果IgA肾病组和Control组J链的表达相对值、IgA分泌、异常糖基化的IgAl分别为(0.85±0.16)vs(0.63±0.28)、(6.64±0.85) pg/ml vs (6.43±0.51) pg/ml、(85.93±7.91) U/ml vs (73.1±8.24)U/ml。IgAN组J链的表达和IgA分泌水平与对照组相比较无统计学意义(t=1.914,P=0.076；t=0.592,P=0.563),而IgAN组Gd-IgAl水平较Control组显著升高,差异有显著的统计学意义(t=3.182,P=0.007)。结论IgA肾病患儿外周血初始B细胞可分化成熟,并产生异常糖基化的IgAl。Tfh细胞及相关细胞囚子在诱生B细胞成为分泌IgA的浆母细胞及半乳糖缺乏的IgAl过程中起关健的调节作用,参与IgAN发病。
[Abstract]:Part one: preparation, identification and immunohistochemistry of IgAN animal models.
Objective to construct a IgAN animal model with mucosal immune induction, based on which the pathogenesis of IgAN and the role of Peyer nodules in IgAN were discussed. Methods male BALB/C mice were given blood. Albumin and staphylococcal enterovenom B induced IgAN model. Zeroth weeks, 6 weeks, and 12 weeks, 24 small urine samples were collected by metabolic cage for 24 hours, respectively. Time urine protein and urine sediment red cell count for.12 weeks to collect serum, serum total protein (TO), albumin (A1b), urea nitrogen (BUN), creatinine (Cr), cysteine protease inhibitor C (Cvs C), and IgA immunofluorescence of kidney tissue: HE, PAS and DAB staining in kidney tissue. The urine protein of 6W and 12W 24h was (0.61 + 0.26) mg vs (0.67 + 0.22) mg. (3.61 + 0.75) mg vs (0.77 + 0.27) Mg, and (4.15 + 0.82) mg vs (1.09 + 0.51) mg. The erythrocyte count of the sediment was (1.90 + 1.20) /HP, vs (1.30 + 0.95) /HP, (1.80 + 0.92) /HP vs (1.50 + 1.08) /HP, (2.50 + 1.18) HP vs (2 + 0.82) /HP, IgAN group 0W, 6W, and urine sediment red cell count was not statistically significant. With IgA deposition, only 2 glomeruli in 40 mice of group Control had a small amount of IgA deposition, and IgA was deposited in the glomerular mesangial region. (3) the serum Alb decreased (P0.05), Cys C increased (P0.05) in the IgA group, and TP.BUN.Cr had no statistical difference (4). (4) immunohistochemical staining showed that both positive cells were dominant. To be distributed at the junction of the bright and dark areas of the germinal center, the semi quantitative analysis showed that the two groups in the IgAN group were stronger than the Control group, and the difference was statistically significant (P0.01). Conclusion the combination of bovine serum albumin and staphylococcal enterotoxin can successfully induce the IgAN model. It is an ideal method to construct the IgAN model, and it also suggests that the mucosal immune system can be used. It can take part in the occurrence of IgAN.
The second part
Differentiation of IgA secretory cells in Peyer nodules and regulation of Tfh cells
Objective To observe the development and differentiation of B cells secreting IgA in Peyer nodules, and to explain the important role of Peyer nodules in the differentiation of B cells secreting IgA and the significance of follicle assisted T cells to regulate the differentiation of B cells into the secretion of IgA plasma cells. As follows: (1) the blank tube (only cell); (2) cell +CXCR5-APC; (3) cell +CD4-PE; (4) cell +CXCR5-APC+CD4-PE; (5) cell +IgA-FITC; +B220-PerCP: cell +IgM-PE-Cy7; +IgA-FITC+B220-PerCP+IgM-PE-Cy7; +100ulPBS+ APC-CXCR5 (4u1) +PE-CD4 (4u1); -IgA (4u1) +PerCP-B220 (2.Oul) +PE-Cy7-IgM (1.25u1) (1.25u1) (IgAN). Flow cytometry was used to determine Tfh (CXCR5+CD4+) cells, B220+IgM+B lymphocytes, B220+IgA+B lymphocytes and plasma mother cells. The percentage of IgA was 10.6% + 2.49%vs 4.88% + 1.41%, 34.7% + 11.1%vs 24.3% + 7.84%, 7.92% + 2.21%vs5.75% + 2.10%, 5.57% + 1.75%vs 3.74% + 1.46%, Tfh cells and IgA white fraction in 13.5% + 3.62%vs 9.49% + 2.14%.IgAN groups and IgA (P0.01), B220+IgM+B lymphocyte, B220+IgA'B lymphocyte The IgA+ plasma mother cells were higher than the Control group (P0.05). Conclusion the percentage of Tfh cells in the Peyer nodules of the IgAN model mice increased, suggesting that Tfh cells play a role in the differentiation of B cells into the plasma cells that secrete IgA; Peyer nodules B cells develop and are predominant to the secretion of the IgA plasma mother cells. The sites provide a microenvironment for B cells to convert IgA to the plasma cells and IgAN.
Determination of Tfh cell function in the third part of Peyer nodules
Objective to determine the level of anti bovine serum albumin (anti -BSA) antibody in Peyer nodules, to indirectly reflect the function of Peyer nodules in Tfh cells and to explore the changes of Tfh cell function in Peyer nodules of IgA nephropathy. Methods to separate Peyer nodules, magnetic beads were used to separate CXCR5+CD4+ cells from Peyer nodules, co culture with autologous splenocytes, and the eighth day Western blot assay supernatant was resistant to inhibition. The content of SA reflected the function of Tfh cells. Results the anti -BSA expression level of the supernatant in the IgAN model group and the Control group was 0.58 + 0.10 vs 0.31 + 0.08.IgAN group and the -BSA concentration was higher than the Control group, and the difference was statistically significant (t=2.97, P=0.01). These results suggest that Tfh cells play an important role in regulating the differentiation of B cells into plasma cells secreting IgA.
The fourth part is the expression of Tfh cell related transcription factors and cytokines in Peyer summary.
Objective to determine the expression of Tfh cell secretory factor leucocyte -21 (IL-21) and transforming growth factor - beta 1 (TGF- beta 1) mRNA, to determine the expression of IL-21 Bcl-6 and 1 white matter in Blimp-1 eggs, to explore the function of Tfh cell related cytokines and their role in IgAN. The expression of IL-21 and TGF- beta 1 mRNA was measured by quantitative PCR reaction. Peyer nodules were isolated, tissue proteins were extracted, and Western blot was used to determine the expression of IL-21, Bcl-6, Blimp-1 proteins. The expression values were higher than those in the Control group, and the differences were statistically significant (t=2.730, P=0.016, t=2.416, P=0.03).IgA group IL-21, Bcl-6 and Blimp-1 (?) protein expression values were 0.67 + 0.21,0.60 + 0.19 and 1.03 + 0.07, respectively, Control group IL-21, 0.45 + 0.21 and 0.67 +. The relative expression values of IL-21, Bcl-6 and B1imp-1 in the IgAN group were higher than those in the Control group (t=2.628, P=-0.025; t=2.665, P=-0.019; t=10.128, P=-0.000). Tfh cells and related cytokines may be involved in the pathogenesis of IgA nephropathy.
The fifth part of Tfh cell related cytokines promotes the differentiation and maturation of initial B cells and secretes lgA1 of galactose deficiency.
Objective To observe the induction of maturation of initial B cells under the action of Tfh cell related factors in children with IgA nephropathy, and to explore the role of Tfh cells in the pathogenesis of IgAN. Methods magnetic beads were used to separate initial B cells (CD27-IgD+) of peripheral blood of children with IgA nephropathy and co culture of IL-21 and TGF- beta 1, and the expression of J chain in cell culture supernatant was determined, and IgA fractions were determined. IgAl (Gd-IgA1) level of lacked galactose. Results the relative value of expression of J chain in IgA nephropathy group and Control group, IgA secretion, the Abnormal Glycosylated IgAl was (0.85 + 0.16) vs (0.63 + 0.28), (6.64 + 0.85) pg/ml vs (6.43 + 0.51) pg/ml, (85.93 + 7.91) U/ 0.85 + 8.24) expression and secretion level with the control group There was no statistical significance (t=1.914, P=0.076, t=0.592, P=0.563), while the Gd-IgAl level in IgAN group was significantly higher than that in the Control group (t=3.182, P=0.007). Conclusion the initial B cells in peripheral blood of children with IgA nephropathy can differentiate and mature, and produce abnormal glycosylated IgAl.Tfh cells and related cell prisoners in the induced cells. IgAl, a secretory IgA cell and a galactose deficiency, plays a regulatory role in Guan Jian, and is involved in the pathogenesis of IgAN.

【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

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本文编号：1813846