乙肝病毒核心蛋白对端粒酶逆转录酶表达的调控作用及其分子机制研究

发布时间：2018-05-02 11:14

  本文选题：乙型肝炎病毒 + HBV　； 参考：《山东大学》2012年硕士论文

【摘要】：研究目的： 1.研究乙肝病毒核心蛋白(Hepatitis B virus core protein, HBc)对人端粒酶逆转录酶(Human Telomerase Reverse Transcriptase, hTERT)表达的调控作用。 2.验证hTERT在HBc调控肝癌细胞生长、增殖中的关键作用。 3.探讨乙肝病毒核心蛋白HBc调控hTERT表达的分子机制。 研究方法： 1.HBc蛋白影响肝癌细胞生长的体内试验研究 课题组前期试验结果显示,HBc可在体外增强肝癌细胞的生长及克隆增殖能力。本论文在此研究基础上,利用裸鼠皮下成瘤模型在体内进一步验证该现象。将HepG2.2.15细胞(1×107个/0.2ml)皮下接种裸鼠,经10d左右肿瘤直径达0.5cm。将成瘤小鼠随机分为两组,每隔3d分别注射2ug pshRNA-HBc质粒和pshRNA-NC质粒,每隔1d测量肿瘤直径大小,计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。2w后,处死裸鼠,取出瘤体,称量瘤重。同时,提取肿瘤组织总RNA, RT-PCR检测hTERT和HBc mRNA的表达情况。 2.HBc蛋白对hTERT基因表达的调控作用 2.1HBc蛋白对hTERT表达的影响 课题组前期实验结果显示,HBc可以促进BEL7402细胞中hTERT mRNA的表达,同时pshRNA-HBc亦可抑制HepG2.2.15细胞中hTERT mRNA的表达。本论文在此基础上,将pcDNA3-HBc-HA质粒和pcDNA3质粒分别转入BEL7402、Hela以及HepG2细胞中,培养48h后提取总蛋白,Western Blot检测hTERT的蛋白的表达情况。同时为了进一步检测hTERT的表达定位情况,我们在Hela细胞中分别转入pcDNA3-HBc-HA质粒和pcDNA3质粒,48h后进行免疫荧光实验,使用荧光抗体标记hTERT蛋白,DAPI染核后利用荧光显微镜观察hTERT的表达及定位情况。 2.2肝细胞肝癌组织标本中HBc与hTERT表达的相关性分析 上述细胞试验完成后,我们又选取了16例肝细胞肝癌(HepatoCellular Carcinoma, HCC)组织标本,分别提取各样本的RNA和蛋白质,RT-PCR检测每例标本中HBc表达情况后,将各组织标本分为HBc阳性和HBc阴性两组。利用Western Blot比较这两组标本中hTERT蛋白的表达情况,光密度扫描分析蛋白表达强度,最后绘制散点图,统计学分析两组标本中hTERT蛋白表达的差异。 3. hTERT在HBc促进肝癌细胞生长中的作用 为了进一步研究HBc, hTERT和细胞增长之间的关系,我们将hTERT-si或NC-si与pcDNA3-HBc-HA或pcDNA3表达载体共转染至BEL7402细胞中,绘制生长曲线并进行克隆形成试验,检测BEL7402细胞的生长、增殖情况。另一方面,将hTERT-si或NC-si与HBc干扰质粒共转染至HepG2.2.15细胞,绘制生长曲线并进行克隆形成试验,检测HepG2.2.15细胞生长、增殖情况,反向验证hTERT在HBc促进肝癌细胞生长中的作用。 4.HBc对hTERT启动子活性的调控机制研究 4.1HBc对hTERT核心启动子的调控作用 为了明确HBc影响hTERT表达的机制,将pcDNA3-HBc-HA或pcDNA3表达载体与携带有hTERT核心启动子的报告基因质粒pGL3B-hTERT371分别共转染至BEL7402,HepG2细胞,同时转染pRL-TK作为内参质粒。转染24h后裂解细胞,利用96孔化学发光仪检测样品荧光强度,并对结果进行统计学分析。另一方面,将pshRNA-HBc或pshRNA-NC与携带有hTERT核心启动子的报告基因质粒pGL3B-hTERT371,以及内参质粒pRL-TK共转染HepG2.2.15细胞,转染24h后裂解细胞,利用96孔化学发光仪检测样品荧光强度,并对结果进行统计学分析,反向验证HBc对hTERT核心启动子的调控作用。 4.2HBc调节hTERT启动子活性关键区域的寻找 为进一步明确HBc调节hTERT启动子活性的关键区域,将pcDNA3-HBc-HA或pcDNA3表达载体与一系列截短缺失的hTERT启动子报告基因载体和内参质粒pRL-TK共转染至BEL7402和HepG2细胞。转染24h后裂解细胞,利用96孔化学发光仪检测样品荧光强度。另一方面,利用pshRNA-HBc封闭HBc的表达后,将一系列截短缺失的hTERT启动子报告基因载体和内参质粒pRL-TK共转染至HepG2.2.15细胞。转染24h后裂解细胞,利用96孔化学发光仪检测样品的荧光强度。 4.3HBc调节hTERT启动子活性关键位点的寻找 明确HBc影响hTERT启动子活性的关键区域后,我们通过相应的文献’分析了关键区域中包含的转录因子结合位点,其中包括c-Ets-2的结合位点。结合相关的文献,转录因子c-Ets-2在调控和维持hTERT基因启动子的活性中发挥重要作用。因此,我们设计并构建了c-Ets-2结合位点突变的hTERT核心启动子报告基因载体,将pcDNA3-HBc-HA或pcDNA3表达载体与c-Ets-2结合位点突变或野生型hTERT核心启动子报告基因载体,以及内参质粒pRL-TK分别共转染BEL7402细胞,转染24h后裂解细胞,利用96孔化学发光仪检测样品荧光强度。另一方面,将pshRNA-HBc或pshRNA-NC与c-Ets-2结合位点突变或野生型hTERT核心启动子报告基因载体,以及内参质粒pRL-TK共转染HepG2.2.15细胞,转染24h后裂解细胞,利用96孔化学发光仪检测样品的荧光强度。 5.c-Ets-2蛋白及相关信号通路分子在HBc调控hTERT表达中的作用研究 5.1HBc对c-Ets-2蛋白核转位的影响 结合文献报道,c-Ets-2蛋白的转录调控作用依赖于其从胞浆到胞核的转位过程。因此,我们将pcDNA3-HBc-HA或pcDNA3表达载体转染HepG2细胞,转染24h后,分别提取两组细胞的胞核蛋白和胞浆蛋白,通过Western Blot检测c-Ets-2蛋白在胞质、胞核中的表达变化,明确HBc是否影响c-Ets-2蛋白的核转位。 5.2HCC组织标本中HBc表达与c-Ets-2蛋白细胞定位的相关性分析 在细胞实验的基础上,我们又提取了上述HCC组织标本的胞浆、胞核蛋白,Western Blot检测HBc阳性和HBc阴性两组标本中c-Ets-2蛋白的细胞定位情况,光密度扫描分析蛋白表达强度,最后做出散点图进行统计学相关性分析。 5.3c-Ets-2在HBc调控hTERT基因表达中的作用 为了进一步验证c-Ets-2在HBc调节hTERT表达中的关键作用,我们将pcDNA3-HBc-HA或pcDNA3表达载体与c-Ets-2-si或NC-si分别共转染HepG2细胞,24h后提取RNA, RT-PCR检测.hTERT基因mRNA的表达情况。 5.4HBc对ERK通路活化的影响 已有文献报道3,ERK信号通路的活化可磷酸化c-Ets-2蛋白,进而促进其核转位过程。因此,我们将pcDNA3-HBc-HA或pcDNA3表达载体分别转染Hela和HepG2细胞,24h、36h和48h后提取细胞总蛋白,Western Blot检测p-ERK1/2的表达情况,验证HBc是否影响ERK信号通路的活化。 研究结果： 1.HBc蛋白可促进肝癌细胞的体内生长 在裸鼠成瘤实验中,检测裸鼠体内肿瘤体积大小和瘤重等指标,结果显示pshRNA-HBc注射组的肿瘤的体积和瘤重均明显小于pshRNA-NC质粒注射组(P0.05)。RT-PCR显示pshRNA-HBc注射组肿瘤组织中hTERT的mRNA表达量明显低于对照组。 2.HBc可上调hTERT蛋白的表达 2.1HBc可上调肝癌细胞系中hTERT蛋白的表达 将pcDNA3-HBc-HA或pcDNA3表达载体转染至BEL7402,Hela, HepG2细胞,Western Blot结果显示,转染HBc表达载体组细胞hTERT蛋白表达量显著高于转染空载体组(P0.05)。同时免疫荧光结果显示,hTERT蛋白主要定位于细胞核内,过表达HBc可以显著提高Hela细胞中hTERT蛋白的表达。 2.2HBc阳性肝癌组织中hTERT蛋白的表达显著升高 选取16例HCC组织标本,分别提取各样本的RNA和蛋白质,通过RT-PCR将各组织标本分为6例HBc阴性标本和10例HBc阳性标本。Western Blot检测hTERT蛋白的表达,结果蛋白条带进行光密度扫描,计算相对表达量hTERT/β-actin,统计学分析显示HBc阳性HCC标本中hTERT蛋白表达水平显著高于HBc阴性组(P0.05)。 3. hTERT在HBc促进肝癌细胞生长中发挥重要作用 生长曲线和克隆形成试验的结果显示,过表达HBc可以增强BEL7402细胞的生长和克隆形成能力(P0.05),但hTERT-si的转入使细胞生长显著受抑制,且可逆转HBc对细胞生长和克隆增殖的促进作用(P0.05)。另一方面,小干扰RNA封闭HBc的表达后HepG2.2.15细胞的增殖和克隆形成率受到明显抑制(P0.05),但hTERT-si亦可导致细胞生长速度的减慢,且可消除pshRNA-HBc和pshRNA-NC转染组间细胞生长和克隆形成能力的差异(P0.05)。以上结果从正反两方面验证了hTERT在HBc促进肝癌细胞生长、增殖过程中发挥重要作用。 4.HBc对hTERT启动子活性的调控机制研究 4.1HBc蛋白上调hTERT核心启动子的活性 共转染及双荧光检测结果显示,在BEL7402细胞中,随着HBc蛋白表达量的升高,hTERT核心启动子的活性被显著上调(P0.001),且具有明显剂量依赖性；HepG2细胞中,转染HBc组hTERT核心启动子的活性亦明显高于转染空载体组(P0.05)。另一方面,在HepG2.2.15细胞中,小干扰RNA封闭HBc的表达可明显下调hTERT核心启动子的活性(P0.05)。以上结果显示,HBc可上调hTERT核心启动子的活性。 4.2hTERT启动子-130-197bp区域是HBc发挥调控作用的关键区段 共转染及双荧光检测结果显示,HBc的过表达可以上调BEL7402和HepG2细胞中pGL3B-hTERT371, pGL3B-hTERT306, pGL3B-hTERT197启动子报告基因的活性(P0.05),而HBc对pGL3B-hTERT130启动子的活性无明显影响；另一方面,小干扰RNA封闭HBc的表达可显著降低HepG2.2.15细胞中pGL3B-hTERT371, pGL3B-hTERT306, pGL3B-hTERT197启动子报告基因的活性,而不影响pGL3B-hTERT130启动子的活性。以上结果表明,HBc可能通过hTERT启动子-130-197bp区域来促进hTERT基因的转录。 4.3转录因子c-Ets-2结合位点是HBc激活hTERT启动子的关键位点 相关文献报道1,在-130--197bp区域内存在着c-Ets-2, bHLH2,AP-2, NF-E2/AP2四个转录因子结合位点。鉴于转录因子c-Ets-2在维持hTERT转录活性中的关键作用,我们构建了转录因子c-Ets-2结合位点突变的hTERT核心启动子报告质粒pGL3B-c-EtsMUT。将pGL3B-c-EtsMUT或野生型pGL3B-hTERT371启动子报告基因载体与pcDNA3-HBc-HA或pcDNA3表达载体分别共转染BEL7402细胞。转染24h后提取蛋白,双荧光检测结果显示,HBc的过表达明显上调野生型pGL3B-hTERT371启动子报告基因的活性(P0.05),而对pGL3B-c-EtsMUT启动子报告基因的活性无明显影响。另一方面,在HepG2.2.15细胞中,将pshRNA-HBc或pshRNA-NC与pGL3B-c-EtsMUT或野生型pGL3B-hTERT371启动子报告基因载体共转染HepG2.2.15细胞,转染24h后裂解细胞,双荧光检测结果显示,小干扰RNA封闭HBc的表达明显抑制野生型pGL3B-hTERT371启动子报告基因的活性(P0.05),而不影响c-Ets-2结合位点突变的pGL3B-c-EtsMUT启动子的活性。以上结果提示,转录因子c-Ets-2结合位点为HBc调控hTERT启动子活性的关键位点。 5. c-Ets-2蛋白及相关信号通路分子在HBc调控hTERT表达中发挥重要作用 5.1HBc可促进肝癌细胞中c-Ets-2蛋白的核转位 Western Blot结果显示,HepG2细胞中HBc的过表达可以使c-Ets-2蛋白的胞核表达水平显著升高,而胞浆表达降低。该结果提示HBc可促进细胞中c-Ets-2蛋白的核转位。 5.2HBc阳性HCC组织中胞核c-Ets-2蛋白的表达略有升高 Western Blot检测HCC组织中c-Ets-2蛋白的胞核表达,条带进行光密度扫描,计算相对表达量c-Ets-2/LaminA/C,结果显示,HBc阳性HCC组织胞核c-Ets-2蛋白的表达水平略高于HBc阴性HCC组织,但统计学分析未见显著性差异(P0.05)。 5.3c-Ets-2蛋白在HBc调控hTERT基因表达中发挥关键作用 在HepG2细胞中共转染pcDNA3-HBc-HA或pcDNA3与c-Ets-2-si, RT-PCR结果显示,与NC-si转染组相比,c-Ets-2-si可显著下调hTERT mRNA的表达水平,且可消除pcDNA-HBc-HA对hTERT表达的上调作用。 5.4HBc蛋白可促进ERK通路的活化 Western Blot结果显示,在Hela细胞中,与对照组相比,pcDNA3-HBc转染后36h、48h即可促进p-ERK1/2的表达,同时hTERT蛋白的表达亦被明显上调；在HepG2细胞中,HBc蛋白亦可以促进p-ERK1/2的表达。结合文献,以上结果提示ERK通路的活化可能参与了HBc对hTERT蛋白表达和c-Ets-2蛋白核转位的调控作用。 结论： 1.HBc蛋白可促进肝癌细胞在体内的生长。 2.HBc可剂量依赖性地上调hTERT蛋白的表达,且hTERT在HBc促进肝癌细胞生长中发挥重要作用。 3.HBc蛋白可上调hTERT启动子的活性,且转录因子c-Ets-2结合位点是HBc发挥调控作用的的关键位点。 4. c-Ets-2蛋白及相关信号通路分子在HBc调控hTERT表达中发挥着重要的作用。 意义： 1.该课题第一次提出了HBc对hTERT表达的调控作用,验证了hTERT在HBc调控肝癌细胞生长、增殖中的关键作用,为揭示HBc参与肝癌发生的分子机制提供了直接的实验依据。 2.首次对HBc调控hTERT表达的分子机制进行了深入研究,确定c-Ets-2转录因子结合位点为HBc调控hTERT启动子活性的关键位点,并明确了c-Ets-2蛋白核转位在HBc上调hTERT表达中的关键作用,为HBc蛋白调控基因表达的通路研究提供了新的数据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392.1

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本文编号：1833636