脂联素对高糖刺激下内皮祖细胞的作用及其对氧化水平的影响

发布时间：2018-05-05 00:30

  本文选题：人内皮祖细胞 + 脂联素　； 参考：《第二军医大学》2012年硕士论文

【摘要】：目的 内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells, EPCs)又称为成血管细胞，不仅参与胚胎时期的血管生成，而且参与出生后的血管新生与内皮损伤修复。糖尿病合并心血管并发症患者的EPCs数量减少，功能减退，能够导致血管再内皮化及修复过程受损。脂联素(adiponectin, APN)是一种脂肪源性血浆蛋白，对心血管具有保护作用。APN具有抗炎和抗动脉粥样硬化的作用，可促进血管生成；另外，APN还可以通过调节细胞代谢，来减少心肌缺血再灌注损伤、抑制心肌肥厚性重构。大量研究证明，经过APN干预，可使EPCs的数量增加。然而，APN是否能改善高糖环境下EPCs的数量和功能尚未清楚。为此，我们通过实验给予EPCs不同浓度的葡萄糖干预，观察葡萄糖对EPCs数量和功能的影响；在此基础上，给予不同浓度的APN干预，观察各浓度APN对高糖损伤后EPCs数量和功能的影响以明确APN对EPCs的保护作用，并探讨其可能的机制，为临床治疗代谢综合征性心血管疾病提供新的干预靶点和必要的科学理论依据。 方法 1、EPCs的分离、培养和鉴定：采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，经含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)及10%胎牛血清的M199培养基培养7d，进行形态学、流式细胞仪测细胞分子标志物(CD34、CD133和KDR)和激光共聚焦倒置显微镜下观察培养细胞摄取ac-LDL和结合UEA-I鉴定。 2、不同浓度葡萄糖对EPCs的影响：收集培养4d的细胞，给予不同浓度的葡萄糖(5.5、20、25、30、50mmol/l)干预48h，同步化后用MTT比色法检测EPCs的增殖能力；用Annexin V-FITC法检测EPCs的凋亡率；用荧光探针(DCFH-DA)检测法进行细胞活性氧(ROS)水平检测。 3、APN对高糖环境下EPCs的影响：将培养4d的EPCs分为7组：其中3组细胞分别给予5.5mmol/l葡萄糖、5.5mmol/l葡萄糖+24.5mmol/l甘露醇、30mmol/l葡萄糖干预96h，其余4组细胞先给予30mmol/l葡萄糖干预48h，然后分别给予：1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml APN干预48h。收集细胞，同步化后检测EPCs的增殖、迁移、凋亡及ROS水平。 4、统计学处理方法：用SPSS19.0统计软件进行统计分析，实验数据以X|-±s表示，组间资料比较采用ANOVA，P＜0.05表示差异有统计学意义。 结果 1、EPCs培养和鉴定：密度梯度离心法分离出的外周血单个核细胞圆形透亮，培养4d后出现短梭形贴壁细胞，并有典型细胞集落；培养7d，细胞集落增加明显，梭形细胞增多并呈交叉性生长；用激光共聚焦倒置显微镜观察，细胞摄取DiI-acLDL呈红色荧光，摄取FITC-UEA-I呈绿色荧光，，摄取DiI-acLDL并结合FITC-UEA-I的细胞呈黄色荧光，流式细胞仪分析结果提示：细胞表达KDR、CD133、CD34，其中KDR、CD133、CD34阳性细胞比例为92.32%、10.7%、23.3%。证实培养的细胞是正在分化的EPCs。 2、不同糖浓度对EPCs的影响：当糖浓度分别为5.5mmol/l、20mmol/l、25mmol/l、30mmol/l、50mmol/l时MTT法测出的A值分别为(0.287±0.031)、(0.252±0.034)、(0.242±0.019)、(0.215±0.024)、(0.208±0.017)，凋亡率分别为(8.495±1.279)%、(12.942±1.177)%、(14.770±1.438)%、(16.393±1.216)%、(17.502±1.259)%，DCF法测出的ROS水平(OD值)分别为(0.361±0.053)、(0.468±0.090)、(0.483±0.053)、(0.518±0.081)、(0.613±0.098)。结果提示，随着糖浓度的增高，EPCs的增殖能力下降，凋亡、ROS水平增加(P0.01)；其中当糖浓度为30mmol/l与50mmol/l时，两者相比对EPCs的影响无统计学差异(P0.05)。 3、APN对高糖损伤后EPCs的影响：对以下7组细胞(5.5mmol/l葡萄糖组、高渗组、30mmol/l高糖组、高糖+1.25μg/mlAPN组、高糖+2.5μg/mlAPN组、高糖+5μg/mlAPN组、高糖+10μg/ml APN组)进行检测的结果分析后可以看出与正常糖浓度对照组相比，高渗对照组EPCs的增殖、迁移、凋亡和ROS水平无统计学差异(P0.05)，却显著高于高糖组，说明高糖对内皮祖细胞的影响是糖浓度造成的，而非渗透压。在30mmol/l葡萄糖条件下，EPCs的数量和迁移功能较正常对照组明显下降，细胞凋亡增多，不同浓度APN干预后能明显提高高糖损伤后的EPCs的功能(P0.05)，随着APN浓度的增加，EPCs的增殖与迁移能力增高，凋亡、ROS水平下降(P0.01)。 结论 1、高糖干预可导致EPCs增殖能力下降，细胞凋亡增多； 2、高糖干预后加入APN，EPCs的增殖、迁移能力恢复，细胞凋亡减少，并在一定范围内，其作用随浓度的增加而增强； 3、高糖可以引起EPCs的ROS水平升高、功能受损，而APN可以降低高糖引起的ROS水平，保护EPCs的功能；渗透压对EPCs无影响。
[Abstract]:Purpose

Endothelial progenitor cells ( EPCs ) are also referred to as vascular cells , not only in angiogenesis in the embryonic period but also in the repair of vascular neovascularization and endothelial damage after birth . The number of EPCs in patients with diabetes mellitus complicated with cardiovascular complications is reduced , and the function decreases . It can lead to damage of vascular restenosis and repair . Adironin ( APN ) is a fat - derived plasma protein , which has protective effect on cardiovascular diseases . APN has anti - inflammatory and anti - atherosclerosis effects , and can promote angiogenesis ;
In addition , APN can decrease myocardial ischemia - reperfusion injury and inhibit myocardial hypertrophy remodeling by regulating cell metabolism . However , it is not clear whether APN can improve the quantity and function of EPCs in high - sugar environment . However , it is not clear whether APN can improve the quantity and function of EPCs in high - sugar environment .
The effects of APN on the number and function of EPCs after high glucose damage were observed . The possible mechanism of APN was discussed , and the new intervention targets and necessary scientific theories were provided for the clinical treatment of metabolic syndrome .

method

1 . Isolation , culture and identification of EPCs : Human peripheral blood mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation , cultured for 7 days by M199 medium containing basic fibroblast growth factor ( bFGF ) , vascular endothelial growth factor ( VEGF ) and 10 % fetal bovine serum . The morphological , flow cytometry and laser confocal inverted microscope were used to observe the identification of ac - LDL and UEA - I in cultured cells .

2 . Effects of different concentrations of glucose on EPCs : collecting cultured 4d cells , giving different concentrations of glucose ( 5.5 , 20 , 25 , 30 , 50mmol / l ) for 48h , and detecting the proliferative capacity of EPCs by MTT colorimetric assay ;
The apoptosis rate of EPCs was detected by annexin V - FITC method .
Cell reactive oxygen ( ROS ) level was detected by fluorescence probe ( DCFH - DA ) assay .

3 . The effects of APN on EPCs in high glucose environment were divided into 7 groups : 5 . 5mmol / l glucose , 5.5 mmol / l glucose + 24.5 mmol / l mannitol , 30 mmol / l glucose for 96 h . The rest 4 groups were treated with 30 mmol / l glucose for 48 hours . Then , the cells were harvested at 1.25 渭g / ml , 2.5 渭g / ml , 5 渭g / ml and 10 渭g / ml APN for 48 hours .

4 . Statistical treatment : Statistical analysis was carried out with SPSS 10.0 statistical software . The experimental data was expressed by X - ray - 卤 s , and the data between the groups was ANOVA , P < 0.05 .

Results

1 . EPCs were cultured and identified : the peripheral blood mononuclear cells isolated from the density gradient centrifugation method were round and bright , short fusiform adherent cells appeared after 4 days of culture , and typical cell colonies were observed .
After 7 days of culture , the cell colonies increased obviously , and the spindle - shaped cells grew and grew in cross sex ;
Cell uptake of DiI - acLDL showed red fluorescence , the uptake of FITC - UEA - I was green fluorescence , the uptake of DiI - acLDL and the binding of FITC - UEA - I cells showed yellow fluorescence . The results of flow cytometry showed that the percentage of CD133 and CD34 + cells was 92.32 % , 10.7 % and 23.3 % , respectively .

2 . The effects of different sugar concentrations on EPCs were ( 0.287 卤 0.031 ) , ( 0.252 卤 0.034 ) , ( 0.242 卤 0.019 ) , ( 0.215 卤 0.081 ) , ( 0.208 卤 0.098 ) % , ( 17.502 卤 1.259 ) % , ( 0.208 卤 0.098 ) % , ( 17.502 卤 1.259 ) % , ( 0.208 卤 0.098 ) % , ( 17.502 卤 1.259 ) % , ( 0.208 卤 0.098 ) % , ( 17.502 卤 1.259 ) % , ( 0.208 卤 0.098 ) , respectively .
When the concentration of sugar was 30 mmol / l and 50 mmol / l , there was no statistical difference between the two groups ( P0.05 ) .

3 . The effect of APN on EPCs after high glucose was analyzed . The results showed that the proliferation , migration , apoptosis and ROS level of EPCs were significantly higher than those in normal control group ( P0.05 ) .

Conclusion

1 . High glucose intervention can decrease the proliferation ability of EPCs and increase the apoptosis of EPCs .


2 . After high glucose intervention , APN , EPCs proliferation , migration ability recovery , cell apoptosis were reduced , and its effect increased with increasing concentration in a certain range ;


3 . High glucose can raise the level of ROS and function of EPCs , while APN can decrease the level of ROS and protect EPCs .
The osmotic pressure had no effect on EPCs .

【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 祝怀平!230001合肥,孙自敏!230001合肥,汪健!230001合肥,何晓东!230001合肥,戴海明!230001合肥,吴竞生!230001合肥,翟志敏!230001合肥;脐血干/祖细胞的造血潜能和淋巴细胞免疫特性的研究[J];中华器官移植杂志;2001年04期

2 肖志坚;外周血CD34+细胞:骨髓增生异常综合征的一个不良预后因素[J];国际输血及血液学杂志;1993年01期

3 张雁云，张学光，张毅，王江方，谢炜，刘蓓岭，蒋冶棠;肿瘤坏死因子a对辐射损伤小鼠外周血白细胞和骨髓C—kit~+细胞的影响[J];苏州大学学报(医学版);1996年06期

4 郭坤元;回输体外培养造血-免疫祖细胞加快亚去髓剂量化疗后造血-免疫功能的恢复[J];中国肿瘤生物治疗杂志;1997年03期

5 许志祥,胡华成,张学光;Flt3配体临床应用研究进展[J];国外医学.生理.病理科学与临床分册;2000年04期

6 李少松;自体外周血祖细胞移植后的长期造血重建:控速冷冻与非控速冷冻至-80℃的效果比较[J];国外医学.输血及血液学分册;2003年04期

7 Lim R.;Knight B.;Patel K.;J.K.Olynyk;宋平;;干扰素α在体内和体外试验中对肝祖细胞的抗增殖作用[J];世界核心医学期刊文摘(胃肠病学分册);2006年10期

8 单书春,樊华,曹春燕,李守训;骨髓像解析[J];中国医科大学学报;1988年02期

9 王立生;慢性髓细胞白血病骨髓的体外净化[J];中华血液学杂志;1995年10期

10 尉达民,王良绪,宁丰,陈萍生;重组人血小板生成素对人巨核系祖细胞的作用研究[J];中国肿瘤生物治疗杂志;1997年03期

相关会议论文 前10条

1 王清勇;刘素芳;王伟峰;陈屏;姚运纬;;新生SD大鼠岛源性胰岛祖细胞的分离培养与诱导分化[A];中国生理学会2004年消化内分泌生殖学术研讨会论文摘要汇编[C];2004年

2 舒斌;祁少海;黄勇;毛任翔;谢举临;徐盈斌;刘旭盛;;皮肤源祖细胞的培养、鉴定和体外诱导分化[A];第八届全国烧伤外科学年会论文汇编[C];2007年

3 慕宁;高毅;唐力军;;双阴性选择法纯化培养人骨髓多能成体祖细胞[A];肝脏病防治学术研讨会及新进展学习班专刊[C];2005年

4 贲素琴;李小波;徐峰;徐卫华;李雯;吴组群;沈华浩;;Eotaxin/CCR3径路与哮喘小鼠骨髓CD34~+造血干细胞迁移与分化：CCR3mAb的作用[A];华东地区第6届中青年呼吸医师论坛暨浙江省第29届呼吸疾病学术年会论文汇编[C];2007年

5 秦超;莫雪安;陆锐;凌莉;马朝桂;;重症肌无力患者骨髓造血干/祖细胞体外培养及其发病机制的研究[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年

6 蒋丽萍;莫雪安;常维纬;;重症肌无力患者骨髓造血干/祖细胞体外集落培养及其意义[A];中华医学会第十三次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2010年

7 沈云天;田野;陆雪官;黄强;董军;王中勇;;胶质瘤干祖细胞在恶性胶质瘤放射抗拒中作用的初步研究[A];中华医学会放射肿瘤治疗学分会六届二次暨中国抗癌协会肿瘤放疗专业委员会二届二次学术会议论文集[C];2009年

8 刘会兰;孙自敏;汪健;翟志敏;任学雷;戴海明;倪世良;王祖贻;;脐血造血干/祖细胞体外扩增实验研究[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年

9 李莉;何垎;刘兰婷;孟恒星;韩俊领;;乙醛脱氢酶在脐带血造血干/祖细胞中表达研究[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年

10 吴仁华;徐志锋;肖叶玉;吴仁华;;核磁共振频谱技术对神经干/祖细胞代谢特征的研究现状及相关问题[A];中华医学会第16次全国放射学学术大会论文汇编[C];2009年

相关重要报纸文章 前10条

1 冯卫东;科学家分离出人类胚胎中胚层祖细胞[N];科技日报;2010年

2 葛秋芳;心脏中“祖细胞”：受刺激后可长成心脏新组织[N];新华每日电讯;2007年

3 ;全反式维甲酸促进造血干／祖细胞植入的实验研究[N];中国医药报;2003年

4 记者　 郭林;英科学家通过细胞移植恢复盲鼠视力[N];光明日报;2006年

5 杨淑娟;美发现胰腺干细胞扩增关键信号途径[N];中国医药报;2006年

6 何德功;“大脑越用越灵”找到科学依据[N];医药经济报;2005年

7 钱铮;日本新发现,可能修改传统血细胞分化路径图[N];新华每日电讯;2008年

8 葛秋芳;艾滋病病毒会阻止新脑细胞生成[N];中国国门时报;2007年

9 胡德荣;我国发现促肝癌新基因[N];中国医药报;2006年

10 陈丹;眼睛“干细胞”被成功唤醒[N];科技日报;2008年

相关博士学位论文 前10条

1 程敏;CXCR4信号通路在干细胞介导的心血管修复中的作用机制的研究[D];华中科技大学;2010年

2 朱春侠;肝祖细胞体外培养和向肝细胞诱导分化的研究[D];浙江大学;2012年

3 孔渝菡;胚胎神经祖细胞的永生化及其特性鉴定与功能研究[D];重庆医科大学;2013年

4 田登梅;内皮细胞靶向的D1R融合蛋白促进骨髓和肝脏造血干/祖细胞植入的研究[D];第四军医大学;2013年

5 俞瑾;氯丙咪嗪调控神经干/祖细胞增殖和分化的分子机制[D];复旦大学;2011年

6 胡菲菲;小鼠子宫内膜边缘群干/祖细胞的研究[D];南京医科大学;2010年

7 张进;从上皮间充质转化探讨Tbx18阳性心外膜祖细胞向心系细胞分化的机制的研究[D];重庆医科大学;2012年

8 张林;冠状动脉旁路移植术患者骨髓和循环祖细胞的临床研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2011年

9 李红运;p75NTR基因修饰O2A祖细胞对成年大鼠损伤脊髓的修复作用[D];第三军医大学;2002年

10 冯凯;造血干/祖细胞的体外定向诱导分化的临床前研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2002年

相关硕士学位论文 前10条

1 陆华;小剂量MIP-1α联合IL-8体外对造血干/祖细胞保护的实验研究[D];第三军医大学;2001年

2 钟立霖;乙醇及其代谢产物对心肌祖细胞的毒性及H3K9表突变作用[D];重庆医科大学;2010年

3 吴亦凡;人脐血造血干/祖细胞的分离、培养和分子鉴定[D];浙江大学;2004年

4 严晓晔;脐带间充质干细胞对CD34~+祖细胞免疫反应的影响[D];天津医科大学;2010年

5 李静远;胚胎造血干/祖细胞体外培养及扩增的实验研究[D];广西医科大学;2002年

6 吴功强;血液病患者骨髓巨核系祖细胞体外培养的临床研究[D];广西医科大学;2001年

7 鲍春雨;脐血造血干/祖细胞体外扩增及无血清培养的实验研究[D];大连医科大学;2004年

8 王清勇;新生SD大鼠岛源性胰岛祖细胞的分离培养与诱导分化[D];郑州大学;2004年

9 黄美娟;血细胞内源性TGF-β_1、TNF-α的表达与调控及其对造血干/祖细胞增殖的影响[D];福建医科大学;2002年

10 刘会兰;脐血造血干/祖细胞体外扩增实验研究[D];安徽医科大学;2003年

本文编号：1845386