稀有血型筛选中对照品的制备及OK血型系统多态性研究

发布时间：2018-05-08 03:20

本文选题：稀有血型 + 等位基因　；参考：《华东师范大学》2011年硕士论文

【摘要】：目前,国际输血协会(ISBT)正式命名的人类红细胞血型系统有30个,包括近300个血型抗原。除ABO、Rh血型外,还存在一些稀有血型,这些稀有血型在人群中的比例非常低。在临床输血过程中即便供、受血者的ABO、Rh血型都相同,也有可能因为稀有血型不合引起同种免疫输血反应。现有的血清学检测方法仅能检测少数稀有血型抗原,并且在应用时往往还受到抗体缺乏或效价低下的限制。随着分子生物学的发展及其在血型研究中的应用,目前几乎所有血型系统的分子生物学机制都已阐明。根据稀有血型等位基因的单核苷酸多态性(SNP)位点,通过设计序列特异性引物,可以对稀有血型抗原等位基因进行分型。这一方法的优点是高通量,同时又能弥补目前血清学检测中单克隆抗体不足的问题,已越来越广泛的应用于稀有血型筛选中。多重PCR技术筛选红细胞稀有血型即在同一反应体系中加入多对针对不同血型抗原等位基因的序列特异性引物,根据扩增结果进行结果判读的一种技术。但由于待检血型抗原的特殊性,大多数高频率抗原缺失型或低频率抗原的血样较难大量获得,而无法获得相应的血型等位基因对照品,从而限制了血型基因检测技术的应用。我们建立了能够同时筛选Oka、Fya和s三种血型等位基因SNP位点的多重PCR体系,并对438份随机献血者样本进行了筛选。438份样本中共筛选出2例Fy(a-)样本,未检出OK(a-)和s-样本。同时,为了验证我们所建立的多重PCR体系的灵敏性和特异性,我们采用了基于PCR的基因定点诱变技术,成功构建了s和Oka血型等位基因的含有突变SNP位点的标准质粒,以期作为多重筛选体系的高频抗原阴性对照品,以验证多重PCR体系的敏感性和特异性。 OK血型系统是国际输血协会(ISBT)于1999年命名的第24个血型系统,其多态性较为简单,Oka是其唯一抗原。该抗原位于免疫球蛋白超家族分子CD147上,属高频抗原,国内外关于OK(a-)表型罕有报道,目前仅在8个日本家庭和一个高加索人中发现null表型(OK(a-)),在其他人群中还未曾发现。 Oka抗原由BSG基因编码,该基因全长10.8kb,目前发现是多态性位点位于第二外显子上,当BSG基因cDNA274位发生单核甘酸G/A突变时,导致Oka抗原92位氨基酸由原来的谷氨酸被赖氨酸所置换,从而形成罕见的OK(a-)表型。Oka抗原频率非常高,目前国内尚没有关于OK(a-)表型的报道。本文采用全长cDNA测序的方法分析汉族人群OK血型系统BSG基因的多态性,进一步了解OK血型系统在中国人群中的分布状况。共测序分析了42例随机献血员的OK血型系统BSG基因的全长cDNA,检出3处多态性位点,分别为cDNA195位C/T突变、234位C/G突变和327位T/C突变。通过对其编码序列进行分析,表明这些位点突变不会引起所编码氨基酸序列的改变,对其抗原性影响不大。目前关于CD147分子在红细胞上的作用研究较少,且相关研究都是在活体动物中进行的。CD147是一种高度糖基化蛋白,但其糖基化具有组织特异性,即在不同组织中其糖基化程度不同,这可能与其在不同组织中行使不同的功能有关。CD147在红细胞上为单次跨膜糖蛋白,我们通过WB检测,确定其在红细胞上的分子量为55KD,属于高糖型。有人认为红细胞膜上的CD147分子行使与CD47相似的功能,即作为巨噬细胞识别并吞噬衰老红细胞标志,当CD147与其配体结合时,产生抑制吞噬的信号。年老红细胞由于细胞膜上CD147的不断减少,抑制信号减弱,从而被巨噬细胞吞噬。为了验证这种假说,我们通过毛细管离心的方法分离出年轻和年老红细胞,通过流式细胞术检测这两种细胞上的CD147表达量。流式检测结果表明,年老红细胞上的CD147表达量呈现明显的下降趋势,平均下降比达33.56%。但是关于CD147在红细胞上的作用及其配体等方面研究还需要进一步进行。
[Abstract]:At present , there are 30 blood types in human red blood cell system named ISBT , including nearly 300 blood type antigens . In addition to the ABO and Rh blood types , there are some rare blood types , which are very low in the population . With the development of molecular biology and its application in blood type research , the present invention has the advantages of high flux , and can make up for the shortage of monoclonal antibodies in serological detection .

However , because of the particularity of the blood type antigen to be detected , most of the high frequency antigen deletion type or low frequency antigen blood sample is difficult to obtain , and the corresponding blood type allele control can not be obtained , thereby limiting the application of the blood type gene detection technology .

In order to verify the sensitivity and specificity of multiple PCR systems , we have successfully constructed standard plasmids containing mutated SNP sites of s and Oka blood type alleles in order to verify the sensitivity and specificity of multiplex PCR system .

The OK blood type system is the 24th blood type system named by ISBT in 1999 . The polymorphism is simpler , Oka is its sole antigen . The antigen is located on the immunoglobulin superfamily molecule CD147 . It is a high frequency antigen . There are rare reports about OK ( a - ) phenotype at home and abroad . The null phenotype ( OK ( a - )) is only found in 8 Japanese families and a Caucasian population , and has not been found in other populations .

Oka antigen was encoded by BSG gene with a full length of 10.8 kb . At present , it was found that the polymorphism site was located on the second exon , which led to a rare OK ( a - ) phenotype .

CD147 is a highly glycosylated protein . CD147 is a highly glycosylated protein , but its glycosylation is different in different tissues .

【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R446.11;R3416

【参考文献】