OK-432联合聚肌胞诱导小鼠树突状细胞成熟及其抗损伤作用

发布时间：2018-05-10 15:48

  本文选题：树突状细胞 + OK-432　； 参考：《福建医科大学》2012年硕士论文

【摘要】：目的本课题旨在比较体外单独或联合应用TLR配体沙培林（OK-432）和聚肌胞对树突状细胞（dendritic cells,DCs）成熟状态的影响，并将DCs与小鼠前胃癌细胞上清液共培养，，检测DCs存活率，探讨OK-432联合聚肌胞对小鼠前胃癌细胞上清液诱导树突状细胞损伤的保护作用及机制。为临床上获取理想的高成熟状态的DCs提供有效方法及科学依据。 方法采用重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)联合重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)，诱导小鼠骨髓源性的单个核细胞分化为未成熟的DCs（immatureDCs,imDCs），分别经OK-432、聚肌胞或OK-432联合聚肌胞诱导DCs成熟，未成熟或成熟的DCs分别与不同浓度的小鼠前胃癌细胞上清液共培养24小时。电镜和光镜下观察DCs的细胞形态变化，流式细胞仪检测细胞表面抗原CD83和CD86的表达情况，ELISA法测定DCs上清液中IL-12的分泌水平，MTT法测定DCs体外刺激同种混合淋巴细胞增殖的免疫活性；光镜下观察DCs损伤的形态学变化，MTT法测定DCs与不同浓度小鼠前胃癌细胞上清液共培养24小时后的活性，免疫组化法检测DCs中锌指蛋白A20（Zinc finger protein A20,A20）的表达水平。 结果 1联合刺激组诱导的DCs光镜和电镜下最具备成熟DCs的形态学特征。 2流式细胞仪检测结果显示，联合刺激组诱导的DCs，其表面抗原CD83和CD86表达均明显高于单一刺激组（P＜0.01）。 3MTT法检测结果显示，聚肌胞组和OK-432组的DCs刺激淋巴细胞增殖的能力明显增加，与空白组相比，差异有统计学意义（P0.01）；而联合刺激组DCs刺激淋巴细胞增殖的能力又显著高于单独刺激组（聚肌胞组和OK-432组）（P0.01）。 4ELISA法检测结果显示，聚肌胞组（91.19±6.16pg/ml）和OK-432组（92.95±5.68pg/ml）IL-12的分泌量明显增加，与空白组（31.49±4.91pg/ml）相比，差异有统计学意义（P0.01），而联合刺激组DCs IL-12的分泌量（175.69±15.26pg/ml）又显著高于单独刺激组（P0.01）。 5光镜下可观察到小鼠前胃癌细胞上清液损伤DCs的细胞形态学变化。 6MTT法检测结果显示，联合刺激组DCs与前胃癌细胞上清液共培养24小时后，其存活率显著高于其它实验组（P0.01）；OK-432组与聚肌胞组比较（P0.05），存活率差异无统计学意义。 7免疫组化法检测结果显示，聚肌胞组、OK-432组和联合刺激组DCs胞质中的A20蛋白表达水平均升高与空白组相比P＜0.01，其中联合刺激组的A20蛋白表达量最高，与聚肌胞组和OK-432组相比，差异有统计学意义（P0.01）。聚肌胞组DCs内A20蛋白表达水平与OK-432组相比差异无统计学意义（P0.05）。 结论 1OK-432联合聚肌胞诱导的DCs，无论在形态学、表型还是功能学上都具有更高的成熟度。 2小鼠前胃癌细胞上清对DCs有损伤作用。 3OK-432联合聚肌胞可以上调DCs的A20蛋白表达，后者对小鼠前胃癌细胞上清液诱导的DCs损伤有保护作用。
[Abstract]:Objective to compare the effects of TLR ligand OK-432) and polymyocytes on the maturation of dendritic cells (DC) in vitro, and to coculture DCs with mouse gastric cancer cells supernatant to detect the survival rate of DCs. To investigate the protective effect and mechanism of OK-432 combined with polymyocyte on dendritic cell injury induced by supernatant of mouse gastric carcinoma cells. It provides an effective method and scientific basis for obtaining ideal high mature DCs in clinic. Methods Recombinant mouse granulocyte-macrophage colony stimulating factor (rmGM-CSF) combined with recombinant mouse interleukin-4 rmIL-4 was used to induce the differentiation of murine bone marrow-derived mononuclear cells into immature DCs maturation by OK-432, polymyocyte or OK-432 combined with polymyocyte. Immature or mature DCs were co-cultured with different concentrations of mouse pregastric cancer cell supernatant for 24 hours. The morphological changes of DCs were observed under electron microscope and light microscope. The expression of cell surface antigen CD83 and CD86 was detected by flow cytometry. The level of IL-12 secretion in the supernatant of DCs was determined by Elisa. The immunological activity of DCs stimulated the proliferation of allogeneic mixed lymphocytes in vitro was determined by MTT assay. The morphological changes of DCs damage were observed under light microscope. The activity of DCs co-cultured with the supernatant of mouse gastric precancerous cells at different concentrations for 24 hours was determined. The expression of A20(Zinc finger protein A20A20 in DCs was detected by immunohistochemistry. Result 1 the morphologic characteristics of mature DCs were the most obvious under light microscope and electron microscope induced by combined stimulation group. 2 the results of flow cytometry showed that the expression of surface antigen CD83 and CD86 in the combined stimulation group was significantly higher than that in the single stimulation group (P < 0.01). The results of 3MTT assay showed that the ability of DCs to stimulate lymphocyte proliferation was significantly increased in polymyocyte group and OK-432 group, compared with the blank group. The difference was statistically significant (P 0.01), and the ability of DCs to stimulate lymphocyte proliferation was significantly higher in the combined stimulation group than in the single stimulation group (P 0.01). The results of 4ELISA assay showed that the secretion of DCs IL-12 in the polymyocyte group (91.19 卤6.16pg / ml) and OK-432 group (92.95 卤5.68pg/ml)IL-12) was significantly higher than that in the blank group (31.49 卤4.91pg / ml), while the secretion of DCs IL-12 in the combined stimulation group was 175.69 卤15.26pg / ml higher than that in the control group. 5 the morphological changes of DCs damage in the supernatant of mouse gastric precancerous cells were observed under light microscope. The results of 6MTT assay showed that the survival rate of DCs combined with P0.01OK-432 group was significantly higher than that of P0.01OK-432 group and P0.05 group after co-culture with the supernatant of pregastric cancer cells for 24 hours. There was no significant difference in survival rate between the two groups. 7 the results of immunohistochemistry showed that the expression of A20 protein in the cytoplasm of DCs in the OK-432 group and the combined stimulation group was higher than that in the blank group (P < 0.01), and the expression of A20 protein in the combined stimulation group was the highest, compared with that in the polymyocytic group and the OK-432 group. The difference was statistically significant (P 0.01). There was no significant difference in A20 protein expression in DCs between polymyocyte group and OK-432 group (P 0.05). Conclusion 1OK-432 combined with polymyocyte-induced DCS has higher maturity in morphology, phenotype and function. 2 the supernatant of mouse gastric precancerous cell had the effect of damaging DCs. 3OK-432 combined with polymyocytes could up-regulate the expression of A20 protein of DCs, which had a protective effect on the DCs damage induced by the supernatant of mouse gastric cancer cells.
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

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本文编号：1869917