根癌农杆菌介导的橘青霉遗传转化体系的建立及应用

发布时间：2018-05-11 19:23

  本文选题：Pci-laeA + Penicillium　； 参考：《西南大学》2012年硕士论文

【摘要】：背景： 橘青霉(Penicillium citrinum)属于子囊菌亚门,不整囊菌纲,散囊菌目,散囊菌科,青霉属,是重要的工业生产菌株。美伐他汀(mevastatin)是橘青霉产生的重要次级代谢产物,这种聚酮类化合物是甲基戊二酸单酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶抑制剂,通过竞争性结合HMG-CoA还原酶有效抑制胆固醇的生物合成。美伐他汀经过生物转化后生产的他汀类药物是临床治疗高胆固醇血症的首选药物。研究美伐他汀生物合成机制和调控网络有助于定向改造目的菌株,而这些研究首先需要建立一套稳定高效的遗传转化方法。目前,常用的丝状真菌遗传转化方法有：CaCl2-PEG介导的原生质体转化法、电击转化法、醋酸锂转化法、基因枪转化法和限制性内切酶介导的转化法等。由于丝状真菌的复杂性,其遗传转化体系有别于植物细胞、动物细胞和原核生物,因此至今仍有许多种类的丝状真菌未能建立合适的遗传转化体系,以至无法进行深入研究。根癌农杆菌介导的丝状真菌转化(Agrobactirium tumfacience mediated-transformant)由于具有转化效率高、操作简便、受体广泛、单拷贝插入和遗传稳定等优势在很多丝状真菌中得到应用,但在橘青霉中的应用尚未有报道。因此我们选择根癌农杆菌介导的方法来构建橘青霉遗传转化体系。 目的： 本文旨在建立一套能够在橘青霉中实现高效稳定运行的遗传转化系统,为实验室橘青霉的美伐他汀生物合成机制和全局性调控研究奠定方法基础。 方法： 1利用重组DNA技术构建含Pci-laeA的重组质粒载体,探讨抗生素选择、孢子浓度、根癌农杆菌种类、根癌农杆菌浓度、乙酰丁香酮浓度、共培养温度、共培养时间以及共培养方式等因素对根癌农杆菌介导的橘青霉遗传转化的影响,筛选优化出合适的转化条件。 2通过PCR技术扩增橘青霉基因组中增潮霉素B抗性标记基因(Hygromycin B resistence gene)筛选验证阳性转化子,并在无潮霉素B(Hygromycin B)筛选压力的平板上连续传代考察其遗传稳定性。 3对稳定遗传的转化子进行表型观察,并利用HPLC方法测定发酵液中美伐他汀生物合成量。 结果： 1实验结果显示使用50μg/ml的潮霉素B能够筛选到阳性转化子,500μg/ml的头孢噻肟钠可以有效清除残余根癌农杆菌。孢子浓度以107个/ml为佳；农杆菌LBA4404的转化效率略高于EHA105,采用浓度为OD600≈0.8左右的根癌农杆菌效率较好；乙酰丁香酮的最佳浓度为80μg/ml；24℃下共培养36h-48h时效率最高；液体共培养技术简便有效。 2利用PCR技术成功从转化子中扩增出hyg抗性标记基因,阳性转化子筛选成功。在无Hyg筛选压力的连续5次传代下,90%的转化子可以稳定遗传。 3表型观察的结果发现,野生型橘青霉与Pci-laeA基因转化株相比其菌丝由淡黄色变成灰白色,孢子和菌丝形态无显著改变。 4美伐他汀产量检测结果显示,Pci-laeA基因转化株的美伐他订生物合成量有显著提高。 结论： 本研究成功建立了以根癌农杆菌为介导的橘青霉遗传转化体系,初步探索了全局性调控因子PCi-laeA的功能。此方法为深入研究橘青霉产美伐他汀的生物合成机制和全局性调控因子的功能研究奠定了基础。
[Abstract]:Background :

The present invention has the advantages of high conversion efficiency , simple operation , wide range of receptors , single copy insertion and restriction enzyme - mediated transformation .

Purpose :

The aim of this paper is to establish a genetic transformation system which can realize high - efficiency and stable operation in Penicillium citrinum , which lays a foundation for the study of the biosynthesis mechanism and global regulation of mevastatin of Penicillium citrinum .

Method :

1 . The recombinant plasmid vector containing Pci - laeA was constructed by using recombinant DNA technology . The effects of antibiotic selection , spore concentration , Agrobacterium type , Agrobacterium tumefaciens concentration , acetosyringone concentration , co - culture temperature , co - culture time and co - culture mode on Agrobacterium tumefaciens - mediated genetic transformation of Penicillium citrinum were studied .

2 . The positive transformants were screened by PCR , and the genetic stability of the positive transformants was tested on the plate with the screening pressure of mycin B .

3 . Phenotypic observation was carried out on the stably inherited transformant , and the biosynthesis of mevastatin in the fermentation broth was determined by HPLC .

Results :

1 . The results showed that 50.mu . g / ml of fosfomycin B could be used to screen the positive transformants , and 500 渭g / ml Cefomycin could effectively remove Agrobacterium tumefaciens . The spore concentration was 107 cells / ml .
The transformation efficiency of Agrobacterium LBA4404 was slightly higher than that of EHA105 , and the efficiency of Agrobacterium tumefaciens was better than that of EHA105 .
The optimal concentration of acetosyringone was 80 渭g / ml .
The efficiency was the highest at 24 鈩，

本文编号：1875261