神经干细胞的分化状态影响它们对VEGF的趋化性应答

发布时间：2018-05-12 22:37

本文选题：神经干细胞 + 分化　；参考：《苏州大学》2011年博士论文

【摘要】：在胚胎发育过程中,神经干细胞(neural stem cells, NSCs)不断迁移至特定区域,形成新皮质等结构功能单位,构建出复杂的中枢神经系统,反之,发育期的NSCs迁移缺陷将导致许多神经退行性疾病;成体NSCs同样保留了这一特性,哺乳动物海马齿状回(dentate gyrus, DG)、脑室下区(subventricular zone, SVZ)的NSCs不断迁移至特定区域维持海马和嗅球(olfactory bulb, OB)的神经发生;重要的是,内源或外源移植的NSCs均可以经过长距离迁移定位于神经损伤区域,因此可通过体外移植和体内激活NSCs,重建受损的神经环路,为神经系统疾病的治疗开辟新途径。 NSCs的定向迁移在体内、外实验中均得到了证实,这种迁移的内在机制吸引了越来越多的研究和关注。研究发现,许多生长因子可以介导NSCs的定向迁移,其中包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),它可以和细胞膜上的血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)结合,激活细胞外信号调节激酶(extracelluar signal regulated kinases-1/2, ERK1/2 )、应激活化蛋白激酶/c-jun氨基末端激酶( stress-activated protein kinase/c-Jun NH2-terminal kinase, SAPK/JNK)、p38MAPK和磷脂酰肌醇3激酶/Akt(phosphatidylinositol 3-kinase/Akt, PI3K/Akt)信号通路,进而介导细胞的增殖、分化和迁移。在接受外部刺激后,丝裂霉素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPKs)和PI3K/Akt信号通路将作用于胞内信号分子进而影响细胞骨架相关蛋白,调节细胞伪足的形成及迁移。生理条件下,VEGF是NSCs沿着吻侧迁移流(Rostral migratory stream, RMS)向OB方向迁移的一个重要调节因子;体外实验也发现,VEGF可以诱导NSCs的定向迁移;并且神经系统损伤区域会分泌VEGF,诱导NSCs迁移至神经损伤区域,帮助损伤区域结构和功能的重建,表明VEGF在神经发生和神经损伤修复中具有重要的作用。细胞的迁移涉及到肌动蛋白的聚合、细胞的黏附和肌球蛋白的收缩,在迁移过程中细胞向趋化因子方向伸出伪足,然后牵拉胞体运动。细胞在受到VEGF刺激之后,其内部的黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)及桩蛋白(paxillin)发生磷酸化进而招募踝蛋白(talin)和纽蛋白(vinculin)等肌动蛋白锚定蛋白形成黏着斑,参与细胞的迁移。paxillin表达降低或者缺失会导致细胞形态变圆,扁平伪足不能形成,黏附及迁移能力下降,而成纤维细胞缺失该基因后表现出迁移能力缺陷,说明paxillin在细胞的迁移中扮演着重要的角色。尽管NSCs能够迁移至神经损伤区域,但研究发现并不是所有移植入体内的NSCs都具有这种定向迁移能力,大部分移植的细胞停留在原地,只有小部分移植入体内的NSCs可以迁移至损伤区域,说明对趋化因子产生应答的可能只是一少部分细胞。体外实验也发现,将50 ng/ml的VEGF加入到神经球的培养基中,从神经球中向外迁移的细胞距离明显变长,并且通过免疫荧光染色发现,这些向外迁移的细胞呈GFAP和nestin阳性,而位于神经球中心的细胞不带有上述的标志物。因此我们推测细胞的迁移能力和它们的分化状态密切相关,不同分化状态的细胞对VEGF的应答不同。为了验证上述假说,我们选用了来源于新生小鼠小脑的NSCs细胞系C17.2细胞,检测了VEGF诱导的NSCs的定向迁移和它们分化状态之间的关系,得到了以下结果: 神经干细胞的分化过程具有可塑性为了探讨NSCs的趋化性迁移和它们分化状态之间的关系,将融合度达50%的C17.2细胞换用诱导培养基,分别取分化0 h(未分化)、12 h、1 d和3 d的细胞进行免疫荧光染色。结果发现,未分化的C17.2细胞表达神经干细胞的表面标志物nestin,不表达其它神经类细胞的表面标志物A2B5、GFAP、β-III-tubulin和NSE。随着分化时间的延长,表达nestin的细胞比例逐渐下降,而表达A2B5、GFAP或β-III-tubulin的细胞比例逐渐增加;在整个分化过程中我们始终没有检测到成熟神经元标志物NSE的表达。接着我们将分化12 h、1 d和3 d的细胞重新培养在含血清的完全培养基中,48 h后发现,神经元样和星形胶质细胞样形态的细胞又返回到了未分化时的形态,主要呈现梭形或三角形,并且细胞出现了大量增殖的现象。说明这些分化的细胞只是处于NSCs分化的早期或是过渡阶段,还不是真正成熟的神经类细胞。神经干细胞的迁移与它们的分化状态密切相关利用Boyden chamber我们检测了不同浓度的NSCs诱导分化0 h、12 h、1 d和3 d NSCs的定向迁移情况。结果发现,未分化的细胞对25和50 ng/ml的VEGF表现出了趋向性迁移,而5和100 ng/ml的VEGF对未分化细胞的迁移没有影响。但同时我们发现分化1 d和3 d的细胞对所有浓度的VEGF均表现出了趋向性迁移;而分化12 h的细胞对5、25和50 ng/ml的VEGF表现出了趋化性迁移。并且诱导分化0 h、12 h、1 d和3 d细胞产生最大迁移细胞数的VEGF的浓度不同,分别为25、5、25和50 ng/ml;VEGF诱导所产生的最大迁移细胞数在未分化和分化12 h、1 d、3 d的细胞中也不相同,分别是对照组的1.68、2.16、3.18和3.16倍。这说明不同分化状态的细胞对VEGF的应答不同,NSCs的定向迁移行为和它们的分化状态密切相关。分化某一特定阶段的细胞拥有较强的定向迁移能力既然细胞的分化状态影响它们的迁移行为,是否存在某一特定分化状态的NSCs向VEGF的定向迁移能力最强呢?通过Boyden chamber我们检测了25 ng/ml VEGF诱导不同分化状态NSCs的定向迁移。尽管未分化和分化12 h、1 d、3 d的细胞对25 ng/ml VEGF都能产生趋化性迁移,但相比于其它分化状态的细胞来说,分化1 d的细胞向VEGF迁移的细胞数最多,说明分化1 d的细胞相比于其它分化状态的细胞来说,拥有较强的定向迁移能力。接着利用Dunn chamber和延时动态视频(time-lapse video)跟踪拍摄,我们检测了不同分化状态细胞在VEGF刺激下的具体迁移指标,包括细胞的迁移速率和迁移效率。结果发现不同分化状态细胞间的迁移速率没有差异,但它们向VEGF迁移的效率并不相同,呈时间依赖的双相性曲线,并且和Boyden chamber结果一致,分化1 d的细胞对VEGF表现出了最强的迁移持续性,其明显高于未分化和分化12 h的细胞。通过上述实验,我们发现神经干细胞的迁移行为和它们的分化状态密切相关,并且某一特定分化阶段的细胞向VEGF的迁移持续性最强,接着我们又检测了原代培养的NSCs的分化状态和它们迁移行为之间的关系。将新生SD大鼠SVZ的NSCs培养在matrigel包被的细胞培养皿中,镜下观察未分化的细胞呈两极或三极形态,大部分细胞呈现nestin阳性。随后将其培养在诱导培养基中,48 h后可见细胞由原来的二极或三极的简单形态变为具有较多和较长分叉的复杂结构,并且细胞表达β-III-tubulin或GFAP,说明NSCs正经历从NSCs向神经类细胞的转变过程中。接着我们选取了分化0 h(未分化)、12 h、24 h和36 h的NSCs,通过延时动态视频跟踪,观察了这些不同分化状态的NSCs在5 ng/ml VEGF刺激下的迁移行为。结果发现分化36 h细胞的迁移速率明显小于未分化和分化12 h的细胞,但其与分化24 h的细胞没有差别。进一步分析细胞的迁移效率发现,迁移效率的变化呈现出时间依赖的双相性曲线,分化12 h的细胞对VEGF的刺激展现出了最强的迁移持续性,再次验证了VEGF刺激下的细胞迁移行为依赖于它们的分化状态,并且某一特定分化阶段的细胞具有较强的迁移能力。 VEGF刺激后,MAPKs、PI3K/Akt以及paxillin在不同分化状态NSCs中的表达不同我们前期实验发现NSCs的趋向性迁移和它们的分化状态相关,那么和细胞迁移相关的MAPKs和PI3K/Akt信号通路对VEGF的应答是否也受细胞分化状态的影响呢?我们通过western blot检测了VEGF处理5、15、30、60和720 min的不同分化状态的细胞,检测了不同分化状态的细胞对VEGF的应答差异。结果发现,VEGF处理细胞5 min后,不论是未分化还是分化的细胞,Akt的磷酸化水平都显著升高,并随着VEGF刺激时间的增加维持稳定表达。同样的,VEGF处理细胞5 min后,p-ERK1/2的表达水平也得到了显著性升高,但不同分化状态的细胞中p-ERK1/2活化持续的时间并不相同,在分化3 d的细胞中p-ERK1/2的增量表达维持到60 min。而在未分化、分化12 h和1 d的细胞中,p-ERK1/2分别在VEGF处理15min、30 min和30 min后恢复到正常表达水平。在不同分化状态的C17.2细胞中,SAPK/JNK的基础性磷酸化表达水平较低,但VEGF作用5 min后,不同分化状态的细胞中均出现了SAPK/JNK蛋白磷酸化水平增高的现象,和p-ERK1/2表达相似,分化0 h、12 h、1 d和3 d细胞中升高的磷酸化的持续时间并不相同,分别持续30 min、1 h、12 h和12 h。而VEGF诱导的p38MAPK的磷酸化只在分化3 d的细胞中出现,VEGF处理15 min时表达增高,30 min后消失。这些结果说明,不同分化状态的细胞中PI3K/Akt、ERK1/2、p38MAPK和SAPK/JNK对VEGF的应答存在着差异。接着我们通过免疫荧光染色鉴定了和细胞迁移密切相关的paxillin和F-actin的表达和分布,结果发现,VEGF刺激细胞5 min后,未分化细胞中paxillin的表达增强,荧光强度和分布面积都得到了显著性升高,F-actin形成整齐的纵向平行排列的纤维,在VEGF作用60 min时,这种现象依旧存在。同时,分化12 h和1 d的细胞在VEGF作用1 min后细胞骨架排列显著有序于未经VEGF刺激的NSCs,并且paxillin偏向于分布在细胞的周围,在我们所检测的60 min内paxillin的表达升高和F-actin整齐排列的现象一直存在。然而,在分化3 d的细胞中paxillin和F-actin的表达及细胞内分布变化不大。 MAPKs和PI3K/Akt参与调控不同分化状态的NSCs向VEGF的迁移MAPKs和PI3K/Akt信号通路对VEGF的应答随着细胞分化状态的改变而改变,那么这些信号通路在NSCs向VEGF的定向迁移过程中有没有作用呢?接着我们分别用MAPKs和PI3K/Akt信号通路的特异性抑制剂处理细胞,利用Boyden chamber检测了在抑制剂存在的情况下,不同分化状态的细胞向VEGF的趋化性迁移情况。结果发现,抑制p38MAPK或SAPK/JNK信号通路后,细胞向VEGF的趋向性迁移没有受到影响;而加入ERK1/2的抑制剂PD98059后,未分化和分化细胞向VEGF的定向迁移行为都受到了抑制;同时我们发现PI3K/Akt的抑制剂LY294002只降低了分化12 h细胞的定向迁移,未分化和分化1 d、3 d的细胞在LY294002存在的情况下仍旧可以向VEGF的浓度方向迁移。说明PI3K/Akt只在分化12 h的细胞中参与调控NSCs的定向迁移,而ERK1/2信号通路在未分化和分化细胞的定向迁移中均扮演着重要的角色。接着我们通过Dunn chamber进一步研究了细胞在抑制剂存在条件下的趋化性迁移。结果发现,ERK1/2信号通路的失活导致了未分化和分化细胞的迁移速率和迁移效率的下降;而PI3K/Akt的抑制剂LY294002只降低了分化12 h和1 d细胞的迁移效率,未分化和分化3 d细胞的迁移效率以及未分化和分化条件下细胞的迁移速率都没有受到影响。和Boyden chamber实验不同的是,尽管SAPK/JNK或p38MAPK信号通路不参与调控细胞的定向迁移行为,但动态视频跟踪细胞,由imageJ软件统计分析细胞的迁移速率和迁移效率可见,p38MAPK的抑制剂SB203580显著降低了分化0 h、12 h和1 d细胞的迁移速率以及分化12 h、1 d和3 d细胞的迁移效率;同时我们发现SAPK/JNK的抑制剂SP600125显著抑制了未分化和分化1 d细胞的迁移速率,分化12 h和3 d细胞的迁移速率以及各个分化状态下的细胞迁移效率没有受到影响。这说明SAPK/JNK和p38MAPK信号通路参与控制细胞的迁移速率和迁移效率,但并不参与调控NSCs向VEGF迁移的方向性。综上所述,这些结果说明不同分化状态的细胞对PI3K/Akt或MAPKs抑制剂的反应不同,进而证实了细胞的迁移行为和它们的分化状态密切相关。 NSCs的体内迁移是神经系统损伤修复的关键因素,其迁移过程并不可能只受到一种因子的调节。事实上,许多因子,包括肝细胞生长因子、干细胞因子、血小板来源的生长因子和单核细胞趋化蛋白-1等都参与调控NSCs的迁移。我们的结果显示分化特定阶段的细胞相比于其它状态的细胞来说,拥有较强的趋向迁移能力,说明NSCs的分化状态在NSCs的定向迁移中扮演着重要的角色。那么相对于未分化和其它分化状态的细胞来说,移植分化特定阶段的细胞将有助于神经系统损伤部位结构和功能的恢复。同时,我们还需要更多的实验来识别这些迁移能力强的细胞,进一步探讨调控迁移的细胞和分子的机制,为临床应用NSCs治疗神经系统疾病提供理论依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

【共引文献】