沙门菌质粒和毒力基因对细胞自噬的影响及其分子机制研究

发布时间：2018-05-18 08:49

本文选题：沙门菌 + 质粒　；参考：《苏州大学》2012年博士论文

【摘要】：目的：通过建立沙门菌感染的细胞模型,观察伤寒沙门菌质粒pRST98及与其密切相关的沙门菌质粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence gene B, spvB)对自噬及感染结局的影响,探讨其发生机制及相关信号通路,以期揭示沙门菌质粒毒力基因增强宿主菌毒力的分子机制,为探索通过调控细胞自噬水平控制沙门菌感染的新途径,并为后续新药靶点的发现及疫苗开发提供实验和理论依据。方法： 1.沙门菌质粒对细胞自噬及感染结局的影响。以携带质粒PRST98的伤寒沙门菌(Salmonella typhi, S.typhi)野生株ST8为实验株,消除pRST98的突变株PRST98为阴性对照株,携带沙门菌质粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence gene, spv)的鼠伤寒沙门菌标准毒株(Salmonella typhimurium)SR-11为阳性对照株,将受试菌与野生型小鼠胚胎成纤维细胞(wide type mouse embryonic fibroblasts, WT-MEFs)及自噬基因5缺陷型小鼠胚胎成纤维细胞(autophagy associated gene5deficient mouse embryonic fibroblasts, Atg5-/-MEFs)体外共培养,制作细胞感染模型。以对数生长期细菌按感染复数(multiplicity of infection, MOI)为100：1感染细胞,同时设立WT-MEFs的自噬激动剂——雷帕霉素(rapamycin, RAPA)干预组。将细胞与细菌共作用1h后吸取上清,此时定为“0"点,加入含有100μg/ml的阿米卡星(Amikacin, AMK)培养液作用2h以去除胞外菌,然后将AMK浓度降为10μg/ml以抑制从感染细胞中释放至培养液中的细菌生长。分别在感染的不同时间段(1h、3h、5h、8h和10h)收获细胞,采用以下方法进行实验检测：①单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin, MDC)染色,荧光显微镜下观察细胞内点状自噬囊泡；②透射电镜(transmission electron microscope, TEM)观察细胞内双层或多层膜结构的自噬小体；③Western Blotting (WB)检测细胞自噬标志蛋白——微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(Microtubule-associated protein1light chain3-Ⅱ, MAP1-LC3-Ⅱ,即LC3-Ⅱ)表达情况；④Annexin.V-FITC/Propidium Iodide (Ann.V/PI)双染流式细胞术(flow cytometry, FCM)分析细胞凋亡率；⑤梯度稀释平板菌落计数法检测胞内集落形成单位(colony forming unit, CFU)。 2.沙门菌质粒毒力基因spvB影响细胞自噬及机制研究。以spvB缺陷的鼠伤寒沙门菌SR-11突变株(SR-11-△spvB)及含有spvB的野生型鼠伤寒沙门菌标准毒株SR-11(SR-11)为研究对象,将实验菌株体外感染WT-MEFs及Atg5-/-MEFs, MOI为100：1,细胞感染过程同第一部分。分别在感染的不同时间段(1h、3h、5h、8h和10h)收获细胞,进行以下实验：①WB检测细胞LC3-Ⅱ蛋白、磷脂酶D(phospholipase D1——PLD1和phospholipase D2——PLD2)蛋白及Toll样受体4(Toll-like receptors4, TLR4)蛋白表达情况；②放射性[9,103H]油酸标记检测感染细胞的PLD活性；③逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)检测细胞TLR4信使RNA (messanger RNA, mRNA)表达情况；④Ann.V/PI双染FCM分析细胞凋亡率；⑤酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测细胞Thl型细胞因子干扰素-γ(Interferon-γ, IFN-γ)及Th2型细胞因子白细胞介素-4(interleukin-4, IL-4)和白细胞介素-13(interleukin-13, IL-13)的表达；⑥梯度稀释平板菌落计数法检测胞内CFU。结果： 1.沙门菌质粒对细胞自噬及感染结局的影响 (1) MDC荧光染色结果：ST8及SR-11感染的各组细胞中,在感染早期,WT-MEFs内可见很少量的点状自噬囊泡颗粒,RAPA干预后,WT-MEFs在感染早期1h点状自噬囊泡颗粒数量增多。感染早期1h,ST8-△pRST98感染的WT-MEFs出现大量的点状自噬囊泡颗粒,3h时颗粒数量减少,RAPA干预的ST8-ApRsT98感染WT-MEFs在早期亦出现数量众多的自噬囊泡颗粒。 (2)细胞超微结构观察：在感染早期1h, ST8及SR-11感染的WT-MEFs内未见自噬小体,RAPA干预后,ST8及SR-11感染的WT-MEFs胞内可见双层膜结构的自噬小体。感染早期1h,电镜下可见ST8-△pRST98感染的WT-MEFs及RAPA干预的WT-MEFs内有典型的双层或多层膜自噬小体。 (3) LC3-Ⅱ蛋白表达：在感染早期1h,ST8及SR-11感染WT-MEFs的LC3-Ⅱ表达较弱,RAPA干预后,ST8及SR-11感染WT-MEFs的LC3-Ⅱ表达明显增强。感染中晚期5h-10h, LC3-Ⅱ在上述各组感染细胞均不表达。感染早期1h和3h,ST8-△pRST98感染的WT-MEFs的LC3-Ⅱ表达较强,且LC3-Ⅱ在1h的表达强度高于3h; RAPA干预WT-MEFs后,LC3-Ⅱ表达明显增加。 (4)3株细菌感染的Atg5-/-MEFs在感染各时间段均没有观察到点状自噬囊泡颗粒、双层膜结构的自噬小体及LC3-Ⅱ表达等自噬现象发生。 (5)细胞凋亡检测结果：ST8感染的各组细胞中,Atg5-/-MEFs和WT-MEFs之间凋亡率无显著性差异,RAPA干预WT-MEFs后,其凋亡率明显降低。SR-11感染各组细胞的凋亡比较结果与ST8感染细胞类似,Atg5-/-MEFs和WT-MEFs之间凋亡率无显著性差异,在以RAPA干预后,WT-MEFs凋亡率显著降低。ST8-△pRST98感染的各组细胞凋亡结果分析显示,在各个时间段,Atg5-/-MEFs凋亡率最高,RAPA干预的WT-MEFs凋亡率高于RAPA未干预的WT-MEFs凋亡率。 (6)梯度稀释法计数胞内细菌数量：ST8感染的各组细胞之间,Atg5-/-MEFs和WT-MEFs的胞内细菌数量无显著性差异,而RAPA干预的WT-MEFs胞内细菌数量显著低于RAPA未干预WT-MEFs组。SR-11感染各组细胞的胞内细菌数量比较结果与ST8感染细胞类似,Atg5-/-MEFs和WT-MEFs之间无显著性差异,RAPA干预后,WT-MEFs内细菌数量明显减少。ST8-△pRsT98感染的各组细胞比较结果显示,Atg5-/-MEFs胞内细菌数量最多,RAPA干预的WT-MEFs与RAPA未干预的WT-MEFs之间无显著性差异。 2.沙门菌质粒毒力基因spvB影响细胞自噬及机制研究 (1)感染细胞LC3-Ⅱ蛋白表达情况：在感染早期1h和3h, SR-11感染WT-MEFs的LC3-Ⅱ表达明显弱于SR-11-△spvB感染的WT-MEFs,在感染中后期5h～10h,LC3-Ⅱ均不表达。 (2)感染细胞PLD1和PLD2蛋白表达情况：在各时间段,SR-11感染细胞的PLD1蛋白表达水平强于SR-11-△spvB感染细胞,而PLD2蛋白表达水平在两株细菌感染细胞之间无显著性差异。 (3)感染细胞TLR4蛋白表达情况：在感染各时间段,SR-11感染细胞的TLR4蛋白表达水平明显弱于SR-11-△spvB感染细胞。 (4)感染细胞PLD活性测定：SR-11及SR-11-△spvB感染细胞的PLD活性均明显高于空白细胞的PLD基础活性；在感染各时间段,SR-11感染细胞的PLD活性均高于SR-11-△spvB感染细胞,1h达到高峰,以后逐渐下降。 (5)感染细胞TLR4mRNA表达情况：在感染各时间段,SR-11感染细胞的TLR4mRNA表达水平低于SR-11-△spvB感染细胞。 (6)感染细胞凋亡率检测：在感染各时间段,SR-11-△spvB感染的WT-MEFs凋亡率显著低于SR-11感染的WT-MEFs及SR-11-△spvB感染的Atg5-/-MEFs凋亡率；SR-11感染的WT-MEFs与Atg5-/-MEFs之间,凋亡率无显著性差异。 (7)感染细胞的细胞因子表达情况：感染早期和中期(1h～5h),SR-11感染细胞的IFN-γ表达水平低于SR-11-△spvB感染细胞组,而SR-11感染细胞的IL-4及IL-13表达明显高于SR-11-△spvB感染细胞组；在感染后期(8h～10h),两株细菌感染细胞的细胞因子表达无显著性差异。 (8)胞内细菌数检测：SR-11感染的WT-MEFs及Atg5-/-MEFs之间胞内细菌数量无显著性差异。SR-11-△spvB感染WT-MEFs的胞内细菌数量显著低于SR-11-△spvB感染的Atg5-/-MEFs和SR-11感染的WT-MEFs胞内细菌数。结论： 1.伤寒沙门菌质粒pRST98可通过抑制细胞自噬促进细菌在宿主细胞内的存活和增殖,从而加重细胞损伤。 2.伤寒沙门菌质粒pRST98抑制自噬的作用与其基因序列上的重要毒力基因spvB密切相关。spvB可通过抑制细胞TLR4表达,促进细胞PLD1表达及增加PLD活性,抑制Th1型细胞因子IFN-γ、促进Th2型细胞因子IL-4和IL-13表达从而导致Th1/Th2免疫漂移等途径抑制细胞自噬。spvB抑制自噬的信号通路与丝氨酸／苏氨酸激酶(serine/threonine protein kinase, AKT)依赖性方式激活TOR激酶(Mammalian Target of Rapamycin, mTOR)密切相关。 3.作用于mTOR靶点的药物——雷帕霉素可减弱沙门菌质粒毒力基因对自噬的抑制作用,从而增强宿主细胞对感染病原菌的杀伤能力,减轻细胞损伤。 4.自噬在沙门菌感染中具有“双刃剑”的作用,适度激活有利于清除胞内感染病原菌,减轻细胞损伤；而其缺失、抑制或过度增强可加重细胞损伤和感染。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of Salmonella typhimurium plasmid pST98 and Salmonella plasmid virulence gene B , spvB on the outcome of autophagy and infection by establishing a cell model of Salmonella infection , and to explore its mechanism and relevant signal pathways , in order to reveal the molecular mechanism of the virulence gene of Salmonella typhimurium , and to explore the new way to control the infection of Salmonella by regulating the autophagy level of cells .

Method :

and its deletion , inhibition or overexpression may aggravate cell damage and infection .
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378.22

【参考文献】