HBHA蛋白对AECⅡ自噬抑制作用机制的分析
发布时间：2018-05-29 14:05
本文选题：结核分枝杆菌 + 自噬 ； 参考：《第四军医大学》2012年硕士论文
【摘要】：结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTb）自1882年被德国细菌学家证实可以引起肺结核以来，已致使世界三分之一的人感染，每年有170万人死于结核病[1]。死亡人数仅亚于艾滋病，位居单一传染病的第二位。极大影响了公众健康。研究证实，肝素结合血凝素（heparin-bindinghemagglutinin adhesin，HBHA）是结核分枝杆菌最主要的粘附分子之一，分子量为28kDa，主要表达于细菌的表面，可结合肝素、硫化右旋糖酐等[2]。它有三个结构功能域，但其在细菌黏附和侵袭肺泡上皮细胞过程中的具体作用未明。 肺泡Ⅱ型上皮细胞是一组具有肺泡保护活性的细胞，同时也可合成和分泌表面活性剂和细胞因子[3]，在天然免疫过程中发挥重要的调节作用。而本课题组在之前的研究中证实，在结核分枝杆菌感染肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞系后，能够抑制A549细胞的自噬作用，结核分枝杆菌中的粘附素HBHA蛋白能够抑制LC3基因的表达，很可能借此阻碍A549细胞利用自噬作用清除结核分枝杆菌。 为进一步阐明HBHA蛋白抑制LC3表达作用的机制，以及由此产生的促进结核菌感染的效应，本课题组分别合成了重组HBHA全长片段、C端缺失片段和N端缺失片段，并分别作用于肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞系，观察其自噬相关基因的表达变化、以及细胞因子释放谱，从而初步阐明HBHA蛋白在MTb感染肺泡Ⅱ型上皮细胞后对其免疫调节作用的影响，探讨其作用机制。具体研究如下： 1、HBHA蛋白纯化、提取并对A549细胞自噬相关基因以及BCG感染效应的影响 本研究对已保存于细菌中的重组HBHA蛋白的全长片段、C端缺失片段和N端缺失片段进行表达、纯化、提取。进行SDS凝胶电泳确定蛋白准确性和纯度。 利用这三段蛋白片段分别作用于A549细胞，利用Western-blot验证其干预LC3和Atg5的表达，以初步阐明HBHA蛋白抑制A549细胞自噬的信号通路。结果发现，三段蛋白均能抑制LC3的表达，但并不能干预Atg5的表达，提示HBHA蛋白不能影响Atg5㧟Atg12复合物的形成，却可以抑制LC3复合物的形成，从而抑制A549细胞的自噬保护作用。 为验证自噬与A549细胞抵抗结核分枝杆菌感染之间的作用，本研究利用BCG作用A549细胞与重组HBHA全长片段、C端缺失片段和N端缺失片段分别与BCG联合后感染A549细胞进行比较，检测其LDH释放量。结果显示，，加入蛋白后其LDH的释放量明显增加。证明抑制自噬后，细胞清除MTb的能力下降，保护作用减弱。为进一步确认HBHA蛋白在MTb感染A549细胞中的作用，本实验利用BCG和HBHA抗体共同作用A549细胞，检测LDH的释放量。结果显示，加入抗体组比只加入BCG感染A549细胞组的LDH释放量显著降低。说明利用抗体封闭HBHA蛋白后，MTb对A549细胞的破坏作用减弱，推测其HBHA抗体在MTb侵袭A549细胞的过程中具有一定的保护作用。 2、检测HBHA蛋白作用细胞后细胞因子的分泌情况 HBHA蛋白抑制自噬的同时，是否参与了炎症反应呢？本研究利用重组HBHA蛋白作用A549细胞，利用ELISA检测其促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ，结果发现A549细胞能分泌IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ五种细胞因子，重组HBHA全长片段能促进A549细胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ，而对于IL-10分泌没有影响。 因此，本研究显示，HBHA蛋白通过其核心α-螺旋结构的作用，抑制了LC3的表达及成熟，从而抑制了自噬,而抗HBHA抗体可以抵消这一作用。同时HBHA可引起炎症因子IL-1β、INF-γ的释放。从而提示，HBHA在MTb感染过程中具有重要的作用，是MTb菌感染、播散以及引起炎性反应的重要毒力因子。
[Abstract]:Mycobacterium tuberculosis ( MTb ) has been infected by a third of the world ' s people since the German bacteriologist confirmed that tuberculosis had been able to cause tuberculosis , and 1.7 million people died of tuberculosis every year . The death toll is only in the second place of the single infectious disease , which affects the public health . The study confirms that heparin - bindin - maglobadhesin ( HBHA ) is one of the most important adhesion molecules of Mycobacterium tuberculosis , with a molecular weight of 28 kDa , which is mainly expressed on the surface of bacteria , which can be combined with heparin , dextran and the like . It has three structural functional domains , but its specific role in bacterial adhesion and invasion of alveolar epithelial cells is unclear .
The alveolar type II epithelial cells are a group of cells with the activity of alveolus protection , but also can synthesize and secrete surface active agents and cytokines , and play an important role in regulating the natural immune process .
In order to further elucidate the mechanism of inhibiting LC3 expression by HBHA protein , and the effect of promoting the infection of mycobacterium tuberculosis , we synthesized the recombinant HBHA full - length fragment , the C - terminal deletion fragment and the N - terminal deletion fragment , respectively , and observed the changes of the expression of the autophagy - related gene and the cytokine release profile respectively . The effect of the HBHA protein on the immune regulation after MTb infection of alveolar type II epithelial cells was observed , and the mechanism of action was discussed .
1 . Purification and extraction of HBHA protein and its effect on the autophagy - related gene and BCG infection in A549 cells
In this study , the full - length fragment , C - terminal deletion fragment and N - terminal deletion fragment of recombinant HBHA protein which have been stored in bacteria were expressed , purified and extracted . The accuracy and purity of protein were determined by SDS gel electrophoresis .
The expression of LC3 and Atg5 was confirmed by Western - blot . The results showed that the three - segment protein could inhibit the expression of LC3 , but did not interfere with the expression of Atg5 , suggesting that HBHA protein could not interfere with the formation of Atg5 ? Atg12 complex , but could inhibit the formation of Atg5 ? Atg12 complex , thus inhibiting the autophagy protection of A549 cells .
In order to verify the effect of autophagy and A549 cells against Mycobacterium tuberculosis infection , the release amount of LDH in A549 cells was detected by BCG and HBHA , respectively .
2 . Detection of cytokine secretion after the action of HBHA protein
The results showed that A549 cells could secrete IL - 1尾 銆
本文编号：1951144
本文链接：https://www.wllwen.com/xiyixuelunwen/1951144.html
最近更新
教材专著
