日本血吸虫童虫期抗原分子的筛选及其Th细胞表位的鉴定

发布时间：2018-05-31 15:49

  本文选题：日本血吸虫 + 童虫　； 参考：《上海师范大学》2011年硕士论文

【摘要】：日本血吸虫病为我国危害严重的人兽共患寄生虫病,严重影响人类健康和社会经济发展,因此控制血吸虫病的扩散和预防血吸虫病的发生意义重大。控制日本血吸虫病流行的主要措施是对人、畜进行药物(吡喹酮)化疗,同时结合传染源控制、环境改造、健康教育等综合防制策略。但实施这一措施费用昂贵,需要大批专业技术人员,且存在不能预防再感染和可能出现耐药性等问题。因此,亟待开发血吸虫疫苗以替代传统的药物治疗方法。 但怎样高效合理地筛选和鉴定出抗血吸虫的保护性抗原一直是个亟待突破的瓶颈。大量研究表明,辐照致弱尾蚴或童虫免疫在多种动物模型上均获得较高的保护性效果;另有研究用经照射尾蚴转变而来获得的童虫在体外培养至肺期,将此时童虫注射进小鼠真皮内,也可刺激引起高水平的保护性免疫反应,表明童虫期某些特殊蛋白抗原可被看作重要的保护性免疫反应的诱导物。此外,一些含有信号肽的分子序列可能分泌到胞外,因而有可能与宿主的免疫系统直接接触诱导产生抗血吸虫的免疫应答,也可能成为潜在的保护性候选抗原。因此,为高效合理地发现抗血吸虫的保护性抗原候选分子,筛选和鉴定在辐照虫体富集的、童虫期高表达的以及具有信号肽等特征的分子序列,可能是个值得探索的方向。 在本研究中,我们采用反向疫苗学策略,从已发表文献中得到的日本血吸虫转录本组数据以及蛋白质组数据并结合中国国家人类基因组南方研究中心公布的日本血吸虫序列筛选出一些目标序列,主要筛选出日本血吸虫肺期童虫表达的分子,辐照的曼氏血吸虫童虫期(4天)富集的分子并通过BLAST方法找到与之同源性最高的日本血吸虫分子序列;通过在线服务器找出这些序列中含有信号肽的序列。然后把能够在肺期童虫中表达的,与辐照曼氏血吸虫童虫(4天)富集分子同源的,以及含有信号肽等特征的日本血吸虫分子序列进行分析比较,结果得到具有如下三方面特征的候选分子:(1)既是肺期童虫高表达又含有信号肽的分子序列21条;(2)既与辐照后曼氏血吸虫4天虫体富集的序列同源又含有信号肽的分子序列2条;(3)既与辐照后曼氏血吸虫4天虫体富集序列同源又是肺期童虫高表达的序列3条。为后续保护性Th细胞表位的预测分析提供了基础。 为筛选候选上述候选分子中可能的保护性Th细胞表位,应用免疫信息学技术对上述26条候选序列进行了Th细胞表位的预测。使用分别基于矩阵和结构算法的HLAPRED和MHCPred服务器预测同HLAⅡ类等位基因分子结合的Th细胞表位;使用基于基序分析原理发展的位置矩阵法的SYFPEITHI服务器预测同HLAⅡ类等位基因分子结合的15肽Th细胞表位;使用MHCPred服务器预测同鼠源H2d型MHCⅡ分子的结合表位;应用基于分子动力学算法的受体配体嵌合空间结合模拟服务器,模拟肽与MHCⅡ类分子的锚定情况,最后得到候选的Th细胞表位: NH-NNSVVIEKSHFLNVL-COOH[AAW26577]; NH-MFGYDKVLPMNSGVE-COOH[AAW26182]; NH-ISVFLFVLTFQYIIS-COOH[AAW24929]; NH-SFFFFLIIHNKIGLA-COOH[AAW25469]; NH-GRVWQVIILTGSYWM-COOH[EZ000175]; NH-MEAFKTFDREGQGFI-COOH[AAW26398] 为后续实验鉴定奠定了理论基础。 为实验证实上述序列分析和表位预测结果,用人工合成多肽法(四分臂偶联法合成到多聚赖氨酸骨架上)合成上述表位肽进行下述实验鉴定:RT-PCR法检测各候选表位肽的源分子序列在日本血吸虫肺期童虫(3天)的表达情况;用流式细胞术检测出其中四条肽与小鼠抗原递呈细胞(APCs)的直接结合情况;用改良的MTT法(CCK-8试剂)测定候选表位肽体外刺激免疫小鼠淋巴细胞增殖;流式细胞术检测免疫小鼠淋巴细胞中CD4+T细胞内细胞因子的分泌情况。 实时定量PCR测定结果表明,这些肽的源序列分子都可以在3天正常童虫期表达。用其中的四条预测肽(P1、P2、P5和P6)体外直接结合鼠脾细胞实验结果表明,43% 88%的细胞被生物素化的肽标记上,用竞争性未标记肽检测显示对标记肽的结合抑制率在56%-93.66%之间,用抗I-Ad和抗I-Ed的抗体竞争孵育检测,结果抑制率分别为68% 87%和49% 75%,分别相似于和高于阳性对照组的抑制率,都可以很好地与小鼠抗原递呈细胞直接结合。淋巴细胞增殖结果表明,除P3肽外,其余5个肽的刺激指数显著高于佐剂对照组的,P2、P4和P6肽组的刺激指数则显著高于多聚赖氨酸骨架组的,说明它们可以不同程度的刺激免疫鼠脾淋巴细胞的增殖。免疫鼠CD4+T细胞内细胞因子的分泌图式测定显示,P1、P2和P5肽体外刺激免疫鼠脾淋巴细胞后,分泌Th1细胞因子IFN-γ的CD4+T细胞的比例要高于分泌Th2细胞因子IL-4的CD4+T细胞的比例,而P4肽诱导的免疫鼠CD4+T细胞分泌细胞因子的图式与上述肽的相反,P3和P6肽则没能诱导免疫鼠产生肽特异的CD4+T细胞相关细胞因子的分泌,初步说明P1、P2和P5肽可能是潜在的Th1细胞表位,P4肽可能是潜在的Th2细胞表位。 总之,我们通过日本血吸虫转录本组学数据的分析和免疫信息学预测,筛选得到了26个日本血吸虫童虫期表达的分子和来源于这些分子中的6个Th细胞表位,并且通过分子与细胞免疫学实验初步鉴定了候选表位肽的免疫原性,为高效快速地筛选日本血吸虫保护性T细胞抗原或表位奠定了基础。
[Abstract]:It is important to control the spread of schistosomiasis and to prevent the occurrence of schistosomiasis . The main measures to control schistosomiasis in Japan are to control the spread of schistosomiasis and prevent the occurrence of schistosomiasis .


But how to efficiently and reasonably screen and identify the protective antigen of anti - schistosomiasis has been a bottleneck that needs to be broken . A large number of studies have shown that the immune response of some special protein antigens to Schistosoma japonicum can be seen as an inducer of protective immune response . In addition , some special protein antigens containing signal peptides may be regarded as an important protective immune response .


In this study , we used the reverse vaccine strategy to screen the data of Schistosoma japonicum and the data of the proteome from published literature , and screened out some target sequences from the sequences of Schistosoma japonicum published by the National Center for Human Genome Southern Studies .


In order to screen the potential protective Th cell epitopes in the candidate molecules , we predict the Th cell epitopes of the above 26 candidate sequences by using the immunoinformatics technique . Using the HLAPRED and MHCPred servers based on matrix and structure algorithm , we predict the Th cell epitopes combined with HLA class 鈪，

本文编号：1960420