通过RT-PCR检测rRNA判定新生隐球菌活力的研究

发布时间：2018-05-31 21:20

  本文选题：新生隐球菌 + 活力　； 参考：《第二军医大学》2012年硕士论文

【摘要】：新生隐球菌和格特隐球菌是重要的病原真菌，常常引起致命的脑膜炎；后者治疗时间长，，复发率较高。目前在隐球菌脑膜炎及其它系统感染的治疗中困扰临床医生的一个重要问题，就是由于无法在治疗过程中对隐球菌的活力做出有效的准确判断，从而对疗程的判定缺乏客观的时间标准。检测rRNA和rRNA基因判断微生物活力，尤其是对于判断微生物在“活而不可培养”状态下的活力有很强的特异性和敏感性。通过检测rRNA判断微生物活性在麻风杆菌、沙门氏菌、酿酒酵母、念珠菌等都显示良好的作用，而对于新生隐球菌和格特隐球菌的研究却未见报道，本课题研究目的是通过检测存活和热灭活的隐球菌rRNA和rRNA基因的特异性片段，探寻判定新生隐球菌活力的特异性rRNA，为后续实验研究奠定基础。 从隐球菌专业中心实验室取新生隐球菌标准株（B3501）接种到固体沙氏培养基活化三天。三天后转种一整环菌体于YEPD液体培养基，振荡混匀后置于振荡培养箱（200r/min，30℃）过夜。振荡培养过夜后，菌悬液理论浓度应该在106-107cfu/ml,以保证后续实验中能提取足够的总RNA;将其中100ml菌悬液置于烧瓶A中，定义为对照组（活菌组），将剩余100ml菌悬液置于烧瓶B中，并用高压锅（121℃,15min）热力灭活，定义为实验组（死菌组）。将对照组和实验组分别用离心机（5000rpm）提取菌体，加入Trizol后，放置室温，提取总RNA后使用试剂盒进行逆转录，合成为cDNA模板，而后以cDNA为模板，进行Real-time PCR实验。数据采用SPSS18.0统计软件包进行分析，结果以均数±标准差（x±s）表示；计量资料两组之间采取独立样本t检验，以P＜0.05为具有统计学差异，P＜0.01为具有显著统计学差异。 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测显示总RNA18s，28s条带清晰，并且28s的量为18s的2倍，表明所得RNA无降解，逆转录后合成cDNA，最后通过RT-PCR方法检测5s，5.8s，18s，28s四个小亚基，死菌和活菌之间表达量均有差异性，CT值差异从大到小依次为：18s，5.8s，28s，5s，且均有统计学意义（P＜0.001）。以CT值差异最小的5s小亚基作为内参，将Ct值转化为△Ct值，结果显示18s活菌与死菌的表达量相差45倍，5.8s相差14倍，通过本课题的初步探讨和研究得出了以下结论。 采用RT-PCR方法检测新生隐球菌四个小亚基的表达量可以对新生隐球菌的活力做出初步判断，尤其是18s和5.8s小亚基，可作为关键亚基，进行检测做出判断。
[Abstract]:Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gertsii are important pathogenic fungi, which often cause fatal meningitis; the latter has a long treatment time and a high recurrence rate. One of the most important problems that currently plague clinicians in the treatment of Cryptococcus meningitis and other systemic infections is the inability to make an effective and accurate judgment of Cryptococcus activity during the course of treatment. Therefore, the judgment of the course of treatment lacks the objective time standard. The detection of rRNA and rRNA genes for the determination of microbial vitality, especially for the determination of microbial activity in the "live but unculturable" state has a strong specificity and sensitivity. The detection of rRNA showed that microbial activity had a good effect on leprosy, salmonella, Saccharomyces cerevisiae and candida, but the studies on Cryptococcus neoformans and Cryptococcus Gertrudii were not reported. The purpose of this study was to detect the specific fragments of the rRNA and rRNA genes of Cryptococcus neoformans and to find out the specific rRNAs to determine the activity of Cryptococcus neoformans and to lay a foundation for further experimental research. The standard Cryptococcus neoformans strain B3501 was inoculated into solid Salmonella medium for three days. After three days, a whole cell was transferred to YEPD liquid medium, and then mixed in a shaking incubator at 200 r / min ~ (30 鈩

本文编号：1961320