人体肠道内产雌马酚菌的分离及其性质的研究

发布时间：2018-06-05 05:38

  本文选题：人 + 肠道细菌　； 参考：《东北农业大学》2012年硕士论文

【摘要】：大豆异黄酮(Soybean isoflavones)是存在于豆科植物体内的一种植物雌激素,其主要苷元成分大豆苷元和染料木素具有广泛的生物学活性。流行病学研究表明大豆异黄酮具有预防乳腺癌、前列腺癌、心血管疾病、骨质疏松以及缓解妇女更年期等症状等生物活性。近年来,随着研究的深入,发现大豆异黄酮在肠道中代谢产生的雌马酚(equol)具有比大豆异黄酮更高的生物活性,性质更稳定,更易被人体吸收,在血浆中的清除速度也更慢,所以推测大豆异黄酮的生物学作用在一定程度上可能归因于雌马酚,但仅有30%-50%的人能将大豆异黄酮代谢为雌马酚。由于雌马酚只能由肠道微生物特异性产生,并且雌马酚的生物学作用和对人群的适用性要优于大豆异黄酮,因此分离出产雌马酚的菌种,为将来用微生物技术方法制备雌马酚具有非常广泛的应用前景。国外有关大豆黄酮降解菌的研究多集中在人和小鼠上,分离获得的肠道内大豆黄酮降解菌也只有少数几种,国内未见从人体内分离出产雌马酚菌的报道。本研究从人体尿样中筛选出雌马酚产生者,采用选择性培养基,从雌马酚产生者的粪样中,分离纯化并鉴定出两株能代谢大豆苷元产生雌马酚的细菌菌株,并对其菌株的性质作了一定探索。 本文首先采用HPLC检测人体尿样中的雌马酚。对HPLC的色谱条件进行优化,使用C18柱,流动相为乙腈：甲醇：水=20：30：50(V/V),流速为1mL/min,雌马酚检测波长为205nm,柱温为25℃。并对检测方法进行验证,结果显示：雌马酚的浓度为0.1-25μg/mL,A与C呈良好的线性关系,其线性回归方程为：A=103170C-10178(R2=0.999)。仪器精密度试验其雌马酚相对标准偏差(RSD)为0.8%。稳定性试验其雌马酚RSD为1.24%。方法精密度试验其雌马酚RSD为1.32%。样品的平均回收率为99.72%,RSD为0.13%。12名受试者中,4名是雌马酚产生者。 在产雌马酚细菌的分离中,采用BHI培养基,加入200μmol/L的大豆苷元作为底物,在厌氧环境中对雌马酚产生者的粪样进行分离培养、纯化获得56株细菌,应用己建立的HPLC分析检测培养液中代谢终产物雌马酚含量,经多次分离纯化得到2个菌株HY-1和HY-2可以产生雌马酚,其产生的雌马酚浓度分别为0.26μg/mL和0.36μg/mL。经细菌生理生化鉴定及16S rDNA序列分析可知,菌株HY-1为兼性厌氧菌,判断为肠球菌属。菌株HY-2为严格厌氧菌,判断为Slackia属。菌株HY-1的16S rDNA序列与Enterococcus faecium同源性为99%。菌株HY-2的16S rDNA序列与Slackia isoflavoniconvertens同源性超过99%。两株细菌在NCBI的GenBank中登陆号分别为JQ768054和JQ796697。 对得到的两个菌株的性质分别进行了研究,通过检测菌株的生长曲线表明,菌株HY-1接种后10h内为细菌的快速生长期,18h后进入衰亡期。菌株HY-2接种后10h内为细菌的快速生长期,14h后进入衰亡期。在菌株培养过程中测定培养基的pH变化情况,菌株HY-1在BHI-大豆苷元培养基中0-6h内pH值下降较快,在6h时达到最低值6.27,之后有回升,48h培养结束后时回升到6.51。菌株HY-2在BHI-大豆苷元培养基中0-8h内pH下降平缓,在8h时达到最低值6.72,之后回升,48h培养结束后时回升到6.83。在温度30-40℃范围内菌株HY-1和HY-2生长较好,属于中温微生物,其中30-35℃为最佳生长温度区间,过高或过低都不利于菌的生长。不同碳源对菌株HY-I和HY-2产雌马酚的影响不同。葡萄糖、麦芽糖、乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和甘露糖促进菌株HY-1产雌马酚,木糖和山梨醇抑制雌马酚的产生。葡萄糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、山梨醇促进菌株HY-2产雌马酚,麦芽糖和乳糖抑制雌马酚的产生。
[Abstract]:Soybean isoflavone ( soybean isoflavone ) is a kind of phytoestrogen present in the body of Leguminosae , its main glycoside component is daidzin and genistein has extensive biological activity . In recent years , it has been found that soybean isoflavone has higher biological activity than soybean isoflavone .

The results showed that the relative standard deviation ( RSD ) of equol was 0 . 1 - 25 渭g / mL , and the average recovery rate was 99.72 % , RSD was 0 . 13 % . Among 12 subjects , 4 were equol .

Strain HY - 1 and HY - 2 were isolated and purified to obtain 56 strains . The results showed that HY - 1 and HY - 2 could produce equol . The results showed that HY - 1 and HY - 2 strain HY - 1 had 99 % identity . The 16S rDNA sequence of strain HY - 2 was more than 99 % . The accession number of strain HY - 2 was JQ768054 and JQ796697 , respectively .

The strains HY - 1 and HY - 2 were cultured in medium temperature range of 30 - 35 鈩，

本文编号：1980808