去泛素化酶对新生隐球菌生长与毒力的多效性调控及机制研究

发布时间：2018-06-05 18:23

本文选题：新生隐球菌 + 泛素化　；参考：《第二军医大学》2012年博士论文

【摘要】：新生隐球菌是临床上重要的病原真菌，主要感染免疫功能抑制的人群，可诱发具有致命威胁的脑膜脑炎。鉴于其明确的有性繁殖周期、健全的动物模型和坚实的分子生物学研究基础，隐球菌已经发展成为人们研究真菌分子致病机制的一种优秀模式病原真菌系统。多年的研究表明真菌病原体的毒力是一种复杂的混合体，其关键毒力因子之间的复杂作用关系以及内在的关键调控机制尚不甚明确。泛素化是真核生物中普遍存在的一种可逆性蛋白修饰机制，，参与调控细胞内中多种重要的生物学过程，如细胞周期、信号转导、有性繁殖、转录调控以及应激应答等。去泛素化酶是泛素代谢系统中重要的蛋白元件，主要通过加工泛素前体蛋白或循环利用泛素维持胞内自由态泛素的稳态从而精细调节泛素介导的蛋白降解或非降解过程。在本研究中，我们应用分子生物学方法构建了7个去泛素化酶的基因突变株，并结合体外应激应答实验、毒力因子检测、有性交配实验以及多种细胞、动物模型以深入探索去泛素化酶蛋白家族对新生隐球菌生长和毒力的功能影响及分子机制。研究发现：与标准株和其它去泛素化酶的基因缺失株相比，UBP5基因敲除后隐球菌生长速率显著下降，对高温环境（37°C部分抑制，39°C完全抑制）、氧化和NO应激、高盐离子、细胞膜/细胞壁应激原以及多种抗真菌药物（如两性霉素B、氟康唑、氟胞嘧啶和卡泊芬净）敏感性显著增高。除此之外，ubp5Δ基因突变株还表现出荚膜生长缺陷、黑色素分泌减少以及有性繁殖能力缺失等多种表型。Ubp5缺失可能并不影响荚膜多糖物质的合成与出胞，可能抑制了荚膜成分在酵母细胞表面的粘附与组装过程；而其黑色素分泌的减少则可能由于其生长速率下降、铜离子代谢失调等因素的复合作用相关；其交配能力缺失主要发生于细胞融合阶段，并与其对alpha性信息素基因的转录调控有关。去泛素化酶Ubp5可能是新生隐球菌在多种应激条件下维持胞内泛素水平稳态的主要去泛素化酶。Ubp5的缺失可能导致胞内自由泛素水平的下降从而对泛素前体蛋白的需求量增强；而多聚泛素在野生标准株中的下调表达导致新生隐球菌出现类似于ubp5Δ突变株的表型变化，如生长速率下降、应激抵抗力下降、有性繁殖能力缺失以及毒力的下降，这进一步说明多聚泛素Ubi4与去泛素化酶Ubp5作用于同一通路以共同调节胞内的泛素水平的动态平衡。而且，去泛素化酶Ubp5的蛋白缺失改变了隐球菌在正常和高温生长条件下的基因转录模式，例如参与调控营养代谢、应激应答反应以及多种基本生物学过程（如DNA复制、转录调控和细胞周期）的功能组基因均出现转录模式的改变。除此之外，新生隐球菌中其它去泛素化酶的基因缺失如DOA4和OTU1对其毒力有着不同的功能影响。尽管其基因缺失株未表现出多种明确的毒力因子表型变化，但是doa4感染巨噬细胞和蜡蛾模型时几乎表现出与ubp5一样的严重毒力缺失，而Otu1则对隐球菌的致病感染发挥负向调控作用，其具体机制尚有待于进一步研究。其它去泛素化酶的缺失（如doa4和ubp13）也表现出某些与ubp5突变株类似的表型变化，如黑色素分泌减少、对某些抗真菌药物敏感性增强等，这提示我们新生隐球菌去泛素化酶存在功能上的重叠性和多样性。我们的研究证实了去泛素化酶对新生隐球菌致病感染过程中的重要调控功能，揭示了新生隐球菌与模式酵母（酿酒酵母）的进化差异性，也为深入探讨去泛素化酶及泛素系统在白念珠菌、烟曲霉菌等其它病原真菌毒力进化中的功能机制提供了一个重要的范本。值得重视的是，去泛素化酶抑制剂是当前抗肿瘤治疗的一个热点方向，去泛素化酶Ubp5对新生隐球菌药物耐受、致病感染具有多重调控作用，具备成为新型抗真菌感染药物或协同治疗靶标的潜质。
[Abstract]:Cryptococcus neoformans is an important pathogenic fungus in clinic , which is mainly affected by immune function . It can induce meningoencephalitis with lethal threat . In view of its definite sexual reproduction cycle , a healthy animal model and a solid molecular biology research foundation , Cryptococcus has developed into an excellent mode pathogenic fungi system for studying the pathogenic mechanism of fungal molecules .

ubiquitination is a kind of reversible protein modification mechanism which is ubiquitous in eukaryotic organisms . It is involved in regulating many important biological processes , such as cell cycle , signal transduction , sexual reproduction , transcription regulation and stress response .

In this study , we used molecular biology method to construct 7 gene mutation strains of deubiquitination enzyme , and combined with in vitro stress response experiment , virulence factor detection , sexual mating experiment and many kinds of cell , animal model to investigate the effect and molecular mechanism of deubiquitination enzyme protein family on the growth and virulence of Cryptococcus neoformans .
The reduction of melanin secretion may be related to the decrease of its growth rate , the imbalance of copper ion metabolism and other factors .
The deletion of Ubp5 may result in the decrease of intracellular free ubiquitin level and enhance the demand for ubiquitin precursor protein .
In addition , the deletion of deubiquitination enzyme Ubp5 changes the gene transcription pattern of Cryptococcus neoformans under normal and high temperature growth conditions , for example , the function group genes involved in regulating nutrition metabolism , stress response reaction and various basic biological processes ( such as DNA replication , transcription regulation and cell cycle ) have changed in transcription mode .

In addition , the deletion of other deubiquitination enzymes such as DOA4 and OTU1 has different functional effects on the virulence of Cryptococcus neoformans .

Our study confirms the important regulatory function of deubiquitination enzyme in the process of pathogenic infection of Cryptococcus neoformans , and provides an important model for further exploring the functional mechanism of deubiquitination enzyme and ubiquitin system in virulence evolution of other pathogenic fungi such as Candida albicans , Aspergillus fumigatus and other pathogenic fungi .
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R379

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