Notch1介导间歇性低氧对幼年小鼠海马神经发生的促进作用

发布时间：2018-06-06 17:15

本文选题：低氧 + Notch1　；参考：《中国人民解放军军事医学科学院》2012年博士论文

【摘要】：间歇性低氧是指连续重复的低氧以及复氧过程。研究发现，慢性及适度间歇性低氧暴露可以促进动物的低氧耐受能力，并且对多种疾病均可以起到预防和治疗作用。另外，间歇性低氧还能减少神经系统损伤，预防和治疗多种神经系统疾病，并且提高中枢神经系统功能。除此之外，间歇性低氧还提高了树突棘相关Rap特异GTP酶（Spine-associated Rap-specific GTPase, SPAR）的表达，从而增强了小鼠海马的长时程增强效应（Long-TermPotential, LTP），进而提高了小鼠的空间记忆能力。目前研究已证实，在成年动物中，活跃的神经发生过程主要存在于以下两个脑区：海马齿状回的颗粒细胞下层(SGZ)以及侧脑室室管膜下层（SVZ）。成体神经发生的一个重要特征即是成体神经发生的各个阶段均对多种生理及病理刺激十分敏感。这些阶段包括神经干细胞的增殖和分化，以及新生神经元的存活、迁移和功能整合等过程。其中，生理性刺激包括体育运动和衰老等；病理性刺激包括脑缺血和癫痫等。最近越来越多的研究表明胚胎和成年动物脑内的神经发生是在低氧环境下进行的。其次，适度低氧环境也存在于多种病理及生理刺激所诱导的神经发生过程中。我们实验室前期的研究显示低压低氧能明显促进成年大鼠脑内的神经发生过程。另外，体外研究也证实，适度低氧环境可以促进体外培养的神经干细胞增殖和向多巴胺能神经元方向的分化。在神经系统的发育过程中，Notch1对维持神经干细胞的未分化状态，调控神经干细胞的自我更新和分化发挥重要的调节作用。Notch1蛋白是细胞膜上的跨膜受体分子,其通过细胞间的相互作用，介导了多种重要的生物学功能，包括器官发生、干细胞的自我更新、细胞命运决定、细胞分化和死亡等。最近有研究显示，Notch1介导了低氧对干细胞特性的维持和对低氧信号的传递。Maria等人通过体外研究发现，低氧可以通过Notch1信号通路抑制神经干细胞和肌肉干细胞的分化，并可激活Notch1下游基因RNA水平的转录，和增加其蛋白水平的表达。另外，研究还发现Noth1信号通路与低氧所诱导的经典的HIF1-α通路存在交互作用，即Notch1可以与HIF1-α在胞内结合，然后一同入核，结合于Notch1的反应元件上，激活Notch1下游基因的表达。以上结果提示我们，Notch1信号通路在低氧所诱导的多个细胞生物学过程中可能具有重要作用。因此，本研究内容包括以下三个方面:首先,探讨外界低氧环境是否可以诱导活体动物脑内的低氧微环境。其次,检测间歇性低氧模型所诱导产生的低氧微环境是否可以促进动物脑内的一系列神经发生过程：包括神经干细胞的增殖和分化，新生神经元的存活和迁移，以及树突棘的发生。最后,探讨Notch1信号通路是否参与了间歇性低氧对动物脑内神经发生的促进作用。具体研究结果如下: 1.活体动物脑内氧分压实时检测我们首先对活体动物脑内氧分压的分布情况进行了观察。实验中，我们在动物大脑冠状平面上选取了两条线，坐标分别是A线(AP,0mm; LR,1.3mm; D,0.0～-9.0mm)，B线(AP,3.6mm; LR,2.0mm; D,0.0～-6.0mm)。测量前，分别在A线起始点(AP,0mm; LR,1.3mm; D,0.0mm)和B线起始点(AP,3.6mm; LR,2.0mm;D,0.0mm)钻孔，接着将氧探头植入大鼠脑内，分别沿着A线和B线进行测量，每间隔0.1mm记录一个测量值，然后根据所测量数据绘制氧分压分布图。结果显示氧分压在活体动物脑内的空间分布是异质性的。其中，脑室内的氧分压要明显高于其他脑实质部位。在脑室内，氧分压可以达到45-50mmHg。然而，在脑实质部位氧分压只有2mmHg左右。接着，我们对不同脑区氧分压的动态变化情况进行了实时检测。实验中，我们分别选取了皮层，侧脑室，海马，第三脑室，丘脑和纹状体，并对以上部位氧分压的动态变化情况进行了检测。我们对侧脑室连续监测1h,对其他部位连续监测10-13min。每隔10min记录一次动物的呼吸频率。结果表明在脑实质部位氧分压相对稳定，均维持在2mmHg左右。在侧脑室，第三脑室以及海马DG区，氧分压处于动态变化之中。侧脑室氧分压在40-50mmHg之间波动，且随呼吸频率的加快而升高。第三脑室和海马DG区的氧分压分别在15-20mmHg和5-8mmHg之间波动。最后，我们对外界低氧环境对活体动物脑内氧分压的影响进行了检测。实验中，我们将活体动物脑内氧分压检测平台搭建在了模拟高原低氧环境的复合舱内，并且分别选取了皮层，侧脑室前部，侧脑室后部以及海马DG区四个部位进行了测量。实验中，我们先对常氧环境下以上几个部位的氧分压进行了测定。然后，我们以5m/s的速度升高所在海拔高度，同时检测大鼠脑内氧分压随外界氧环境变化情况。当所在海拔高度稳定在目的高度后，我们开始实时检测并记录其脑内相应区域氧分压的变化情况，持续30-60min。实验中，我们选取两个目的高度----海拔2000m和海拔3000m。结果显示，随着海拔高度不断上升，周围环境的氧分压逐渐下降。对于侧脑室和海马DG区而言，其组织内氧分压可以随外界环境氧分压的下降而同步下降。但是，对于大脑皮层而言，其组织内氧分压并不随着外界环境氧分压的下降而发生变化。结果表明外界低氧环境可以诱导活体动物侧脑室以及海马DG区低氧微环境的产生。 2.间歇性低氧对小鼠海马神经发生的影响及Notch1的作用实验中，我们首先将出生后2天的野生型和Notch1缺陷型小鼠进行了间歇性低氧处理。间歇性低氧模型如下：每天进行海拔高度为2000m的低氧处理4h，共进行4周。首先，我们检测了间歇性低氧对小鼠海马DG区神经干细胞增殖的影响。实验中，我们分别在间歇性低氧处理后0及14天，给动物注射Brdu进行标记。Brdu标记后立即将动物灌流取脑，进行切片及免疫组化染色。我们发现，对于野生型小鼠，间歇性低氧处理后，小鼠海马DG区Brdu阳性细胞数量比常氧对照组多60%左右。间歇性低氧处理2周后，小鼠海马DG区Brdu阳性细胞的数量仍比常氧对照组多出71.2%。而对于Notch1缺陷型小鼠，间歇性低氧处理后0天以及2周后，海马DG区Brdu阳性细胞的数量与常氧对照组相比并无明显区别。以上结果表明，间歇性低氧处理可以促进小鼠海马DG区神经干细胞的增殖，并且间歇性低氧的这一作用可以持续至少2周。而且，Notch1介导了间歇性低氧促小鼠海马DG区神经干细胞的增殖过程。其次，我们检测了间歇性低氧对新生神经元数目的影响。实验中，我们在间歇性低氧处理后对动物立即进行Brdu标记，然后在Brdu标记后0，14，28天将动物进行灌流取脑处理，并进行切片染色。结果显示，Brdu标记后14和28天，对于野生型小鼠，间歇性低氧处理后其海马DG区Brdu阳性细胞数量比常氧对照组小鼠分别多65.5%和52.2%。而且，间歇性低氧后Brdu和NeuN双标记细胞的数量比常氧对照组小鼠分别多73.1%和54.2%。但是对于Notch1缺陷型小鼠，间歇性低氧并不能促进小鼠海马DG区Brdu阳性细胞以及Brdu和NeuN双标记细胞的数量。以上结果表明，间歇性低氧处理可以增加小鼠海马DG区新生神经元的数量。而且，Notch1参与了间歇性低氧促小鼠海马DG区新生神经元增多这一过程。接着，我们检测了间歇性低氧对小鼠海马DG区新生神经元迁移的影响。Brdu标记方法同以上新生神经元检测实验。结果显示，对于野生型小鼠，我们发现在Brdu标记后14和28天，间歇性低氧处理后迁移进入GCL2区的新生神经元比例要比常氧对照组高出73.6%和43.5%。但是，对于Notch1缺陷型小鼠，间歇性低氧处理后迁移进入GCL2区的新生神经元比例与常氧对照组无明显区别。以上结果表明，间歇性低氧可以促进海马DG区新生神经元向颗粒细胞层内部的迁移，，并且Notch1参与了这一过程。最后，我们检测了间歇性低氧对小鼠海马树突棘发育的影响。我们将Thy1阳性小鼠与Notch1缺陷型小鼠杂交后得到Thy1阳性野生型以及Thy1阳性Notch1缺陷型小鼠。我们将以上两种小鼠进行间歇性低氧处理，然后进行灌流取脑和切片。将以上脑片进行显微照相后，进行统计学分析。结果显示，对于野生型小鼠，间歇性低氧处理后其顶树突棘和基树突棘长度均有所增加。另外，间歇性低氧组小鼠的顶树突棘密度与常氧对照组相比增加了约26%。但是，其基树突棘密度与常氧对照组相比并无明显差异。而对于Notch1缺陷型小鼠，间歇性低氧处理后其海马顶树突棘及基树突棘长度和密度均无明显差异。以上结果表明，间歇性低氧可以增加其海马锥体神经元顶树突棘和基树突棘长度，并且提高其顶树突棘密度。并且，Notch1参与了间歇性低氧促树突棘发生过程。 3.间歇性低氧促小鼠海马神经发生的分子机制研究我们将出生后2天的野生型和Notch1缺陷型小鼠进行海拔2000m，每天4h的间歇性低氧处理，共4周。间歇性低氧处理结束后，分离小鼠的海马组织，并提取海马组织蛋白。然后，分别进行NICD，Hes1以及Hes5的蛋白免疫印迹（Western Blot）实验。最后进行统计学分析。结果显示，对于野生型小鼠而言，与常氧对照组相比，间歇性低氧显著增加了海马NICD和Hes-1蛋白的含量。但是对于Notch1缺陷型小鼠，间歇性低氧处理并没有明显改变NICD和Hes-1蛋白的含量。但是，在各组中，我们均没有发现Hes5表达的变化。以上数据表明，对于野生型小鼠，间歇性低氧激活了Notch1-Hes1信号通路；但是对于Notch1缺陷型小鼠，间歇性低氧并没有明显影响Notch1-Hes1信号通路的活性。以上这一现象可能是间歇性低氧可以促进野生型小鼠海马神经发生，但并不影响Notch1缺陷型小鼠海马神经发生的原因之一。综上所述，我们发现：1.外界低氧环境可以诱导活体动物脑内低氧微环境的产生。2.间歇性低氧所诱导的脑内低氧微环境可以促进小鼠海马神经发生。3.Notch1介导了间歇性低氧促海马神经发生的多个过程。4.间歇性低氧可以激活Notch1信号通路。神经发生与人和动物的学习记忆，脑的损伤修复，以及神经退行性疾病的发生均密切相关。以上研究为我们在多个阶段诱导动物的神经发生过程提供了新的方法和思路，并为提高人类的认知能力，减少脑损伤以及治疗神经退行性疾病提供了新的手段。随着铁路和航空运输业的发展,目前每年有数百万的人进入高原地区。但是研究发现，到达海拔5000米以上的人群中，大约有一半以上会发生急性高原病(acutemountain sickness, AMS)。急性高原病（AMS）是指：到达海拔2500米以上的高原非习服人员发生的头痛并同时伴有的肠胃不适（例如，厌食，恶心，呕吐）；失眠；眩晕；无力或者困乏等症状。在患有急性高原病的人群中，一部分人会发生高原脑水肿，其特征为不同程度的意识错乱、共济失调、意识障碍、精神变化，并可能进而发展为深度昏迷乃至死亡。许多化学物质介导了急性高原病和高原脑水肿过程，其中包括：一氧化氮，腺苷，氧自由基，VEGF等。以上这些化学物质均可以使血管基膜损伤，从而引起血管源性水肿。目前急性高原病和高原脑水肿的处理方式包括：迅速降低所在海拔高度，氧气供给和给予地塞米松、乙酰唑胺，以及高压舱治疗。热休克蛋白(Heat strock proteins, HSPs)是由细胞内高度保守的热应激基因编码的产物，它们可由一系列应激因素诱导产生。热休克蛋白包括多个家族，其中以热休克蛋白70（HSP70）在热应激中升高最明显，其作用机制也了解最清楚。HSP70具有分子伴侣活性，即结合并稳定蛋白构象，帮助被结合蛋白折叠，转运以及释放。HSP70是免疫系统识别的主要抗原，具有维持细胞内稳态和抗凋亡作用。近些年研究发现，外界低氧环境也可以诱导HSP70的表达。另外，HSP70作为低氧应激的标记分子已经受到越来越多人的关注。更为重要的是，HSP70也可对多种器官的缺血缺氧损伤起到保护作用。研究发现，HSP70的诱导可以减少低氧对肝脏和肺组织的损伤。另外，其对脑缺血和心肌缺血损伤也可以起到保护作用。替普瑞酮(geranylgeranylacetone,GGA)，是一种维甲酸类物质，其可以在多种组织内诱导HSP70的合成。研究发现，GGA对消化系统的多个器官损伤均具有保护作用，包括萎缩性胃炎，胰腺炎以及小肠和结肠上皮细胞氧化损伤等。此外，GGA还可以通过诱导HSP70对软骨细胞，视网膜，耳蜗，肺，肾以及心肌细胞的应激损伤起到保护作用。近些年研究发现，GGA对中枢神经系统的缺血缺氧损伤也起到一定的保护作用。研究者在小鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MACO)手术前1小时给予动物GGA预处理，发现其可以显著诱导梗死区边缘神经元和神经胶质细胞HSP70的表达，并明显减少脑梗死面积。Nagai也报道了GGA的预处理对HSP70的诱导及其脑缺血保护作用。目的1.证实GGA的抗急性低氧损伤和脑保护作用，寻找新的预防急性低氧损伤的药物。2.初步明确GGA抗急性低氧损伤和脑保护的作用机理，为高效低毒的预防急性低氧损伤药物的出现提供新思路。方法 1．致死性急性低氧暴露以及存活率和存活时间测定：急性低氧暴露开始前1h，GGA预处理组小鼠腹腔注射1000mg/kgGGA溶液，实验对照组小鼠腹腔注射相同体积的配置GGA溶液所采用的空载体，即含有0.0056%维生素E的2%阿拉伯树胶溶液,并将GGA预处理组以及对照组小鼠均放入低压低氧透明动物实验舱中适应30min。接着，将低压低氧舱中的模拟海拔高度以大约50m/s的速度上升至海拔10000米，即致死性低压低氧环境（在这一低氧环境中，小鼠会在一定时间内死亡）。在海拔10000米的低氧环境中维持15min。小鼠存活率以及存活时间测定：模拟海拔高度上升至10000米后便开始对GGA预处理组和对照组小鼠存活率以及存活时间进行测定。小鼠停止呼吸30秒以上即判定为死亡。小鼠存活时间为海拔高度上升至10000米后到小鼠停止呼吸的时间。小鼠存活率为存活小鼠数量占小鼠总数的百分率。本实验采用双盲法进行测定。 2.非致死性急性低氧暴露对脑组织损伤的病理学检测: 非致死性急性低氧暴露主要用来造成小鼠的急性低氧损伤，但并不危及其生命。方法如下：以大约10-20m/s的速度上升至海拔8300米，维持6小时后将小鼠取出。常氧对照组小鼠GGA预处理后放在打开舱门，并维持常氧环境的透明动物实验舱中，6小时后取出。戊巴比妥钠（50mg/kg,i.p.）腹腔麻醉小鼠，并进行小鼠的灌流固定，脑的冰冻切片，以及Nissl染色。 3.非致死性急性低氧暴露前后脑组织HSP70蛋白检测：分别在GGA注射后1h,7h,以及GGA注射后1h+急性低氧暴露6h三个时间点,立即取出动物，断头处死，开颅取脑，分离小鼠海马和皮层，并进行以上两个组织的总蛋白提取。经过SDS-PAGE电泳，电转，抗原抗体反应以及显色等步骤，来对不同组小鼠海马及皮层的HSP70蛋白的表达进行检测。 4.非致死性急性低氧暴露前后脑组织一氧化氮合酶(NOS)活性检测: 分别在GGA注射后1h,7h,以及GGA注射后1h+急性低氧暴露6h三个时间点,立即取出动物，断头处死，开颅取脑，分离小鼠海马和皮层，并进行以上两个组织的总蛋白提取。测定各组总一氧化氮合酶（TNOS）以及诱导性一氧化氮合酶（iNOS）活力。具体测定方法同“南京建成生物工程研究所一氧化氮合酶检测试剂盒”说明书（货号：A014-1）。 5.数据处理和统计学分析：灰度分析采用Quantity One软件（BIO-RAD）；图像分析采用Adobe PhotoshopCS29.0软件（Adobe Systems Incorporated）;数据的记录、处理、运算、作图和统计学分析应用Microsoft Excel2003(Microsoft Corp.)软件进行，其结果用平均值±标准差(Mean±SD)表示。结果 1. GGA预处理提高小鼠对致死性急性低氧的耐受能力：研究发现，约有三分之二的对照组小鼠在海拔10000米急性低氧暴露的前三分钟内便死亡(Fig.1;平均存活时间：4.28±4.29min, n=15)。海拔10000米的急性低氧下暴露15min后，我们发现对照组小鼠的存活率降至6.67%。而当我们在急性低氧前1h给予1000mg/kgGGA预处理后，小鼠在海拔10000米的急性低氧环境中平均存活时间与对照组相比延长了大约5min（Fig.1; GGA预处理组平均存活时间为9.55±3.12,n=16, P0.005vs.对照组）。其存活率与对照组相比也增加了三倍左右，达到了18.75%。这一结果提示，GGA可以提高动物对急性低氧的耐受能力。 2. GGA预处理减轻急性低氧导致的小鼠皮层及海马组织损伤：研究发现，急性低氧对照组小鼠皮层神经元出现了皱缩和排列散乱的现象。但是，急性低氧前1h给予动物1000mg/kgGGA预处理（GGA预处理组）可以明显减轻皮层神经元的皱缩。另外，我们发现，急性低氧对照组海马CA2和CA3区神经元同样也出现了皱缩，排列散乱以及着色减弱等现象，以上结果说明8300m的非致死性急性低氧暴露可以使得海马CA2和CA3区神经元胞内尼氏体丢失，损伤，甚至死亡。而1000mg/kgGGA预处理后，可以明显减轻急性低氧暴露对神经元的损伤，表现为神经元皱缩减弱，排列更加整齐，并且染色加深(Fig.2O,P,W,X)。以上结果表明，GGA预处理可以减轻急性低氧导致的小鼠皮层及海马组织损伤。 3. GGA预处理诱导皮层及海马组织HSP70的表达: 研究发现，1000mg/kgGGA预处理1h后，与对照组相比，小鼠皮层（Fig3. a,c）及海马(Fig3.b,d)的HSP70表达水平显著升高，分别大约升高了2.7倍和1.3倍。而GGA预处理7h后以及预处理1h并急性低氧6h后对HSP70的诱导作用不如GGA预处理1h明显。以上研究表明，GGA对HSP70的诱导是一个较为迅速的过程，并可能参与了GGA对急性低氧损伤的保护作用。 4. GGA预处理可以抑制皮层及海马组织TNOS及iNOS活性：研究结果显示，在大脑皮层，1000mg/kgGGA预处理可以降低急性低氧暴露所升高的iNOS活力（Fig4.C；对照组：1.46±0.26U/mgpro VS. GGA预处理组：1.08±0.15U/mgpro; P0.05）同样，在海马中，1000mg/kg GGA预处理也使得急性低氧暴露后升高的TNOS（Fig4b;对照组：3.93±0.62U/mgpro VS. GGA预处理组：3.44±0.84U/mgpro）和iNOS活力有所下降（Fig4d;对照组：2±0.44U/mgpro VS.GGA预处理组：1.69±0.35U/mgpro）。以上结果表明GGA预处理可以抑制皮层及海马组织TNOS及iNOS活性。结论 1.本研究证实了GGA预处理可以提高小鼠对急性低氧的耐受能力，并减轻急性低氧暴露对小鼠皮层以及海马组织的损伤。 2.本研究发现GGA预处理可诱导HSP70的表达，并降低急性低氧暴露所升高的皮层iNOS活性。推测GGA预处理对急性低氧损伤的保护机制可能是GGA预处理所诱导表达的HSP70可以抑制iNOS活性，从而减少了NO的含量，减轻了急性低氧对大脑的损伤。 3．本研究为治疗高原病和预防高原脑水肿提供了新的思路和治疗手段。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】