家族型肌萎缩侧索硬化动物模型脊髓侧角神经元的特征

发布时间：2018-06-13 22:21

  本文选题：脊髓侧角 + 乙酰胆碱酯酶　； 参考：《河北医科大学》2012年硕士论文

【摘要】：目的：肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种病因未明神经系统变性病，选择性损伤大脑皮层运动神经元、脑干运动神经核神经元、脊髓前角a运动神经元，导致进行性加重的肌肉无力、萎缩，最终因呼吸肌麻痹死亡。近年来研究发现部分ALS患者存在自主神经系统、锥体外系系统、感觉系统等非运动神经区域受累的症状，提示ALS可能是一个多系统累及的神经变性疾病。Murata Y发现ALS伴发昼夜血压的变化,血压与心率之间的相关性的降低，严重可诱发循环衰竭、心律失常乃至猝死[1]；及其他自主神经异常的表现如：排汗增加及减少[2]、唾液分泌减少[3]、胃排空时间延长[4]等改变。 Takahashi H及Kennedy PG分别报道ALS患者胸髓中间外侧核神经元的丢失[5-6],Itoh T发现神经元免疫活性的改变[7]及Kihira T也在萎缩神经元胞浆内发现了包涵体[8]，比如Onuf,s核的bunnia小体。在SOD1(V118L)基因突变的家族型ALS患者短期内出现自主神经衰竭，尸检发现延髓自主神经核及中间外侧柱明显的神经元丢失[9]。对SOD1~(G93A)转基因小鼠研究发现安静状态下早期转基因鼠心率增高，提示疾病早期自主神经功能损伤[10]。 交感神经的低级中枢位于脊髓胸1（T1）至腰2-腰3（L2或L3），组成了中间外侧柱(IML)，在调节自主神经功能方面具有重要作用。 本实验拟应用甲苯胺蓝染色及免疫组化的方法，观察家族型肌萎缩侧索硬化动物模型（SOD1~(G93A)转基因小鼠）病程不同阶段脊髓侧角神经元的结构及乙酰胆碱酯酶的表达情况，旨在探讨脊髓侧角神经元在ALS的发病过程的变化特征，为ALS发病机制研究提供一定的理论基础。 方法： 1模型建立及分组 饲养繁殖家族型肌萎缩侧索硬化动物模型SOD1~(G93A)转基因小鼠，参考Vercelli A[11]等的1-5分评分法进行评分,4分为发病时间，1分为死亡时间,60天为症状前期，4分为症状早期，1分为终末期。各对照组为同窝、同月龄未转人突变的SOD1基因的小鼠。每组各3只小鼠。 2取材 10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，心脏灌注4%多聚甲醛固定20min，取小鼠脊髓胸段将其分成上段（T1-T3）、中段（T4-T6）、下段（T7-T9），分别以4%多聚甲醛固定48h。 3甲苯胺蓝染色 后固定的组织块经梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续组织切5μm片，进行甲苯胺蓝染色。依据Oppenheimer定量组织学方法[12]，计数脊髓侧角神经元。 4免疫组化染色 10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，心脏灌注4%多聚甲醛固定30min，取小鼠脊髓胸段将其分成上胸髓（T1-T3）、中胸髓（T4-T6）、下胸髓（T7-T9），分别以4%多聚甲醛固定12小时，震荡切片25μm厚，应用乙酰胆碱酯酶进行免疫组化染色。 5统计学处理 采用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计处理。采用均数±标准差表示上段（T1-T3）、中段（T4-T6）、下段（T7-T9）各脊髓切片两侧神经元计数之和，三组数据的比较采用单因素方差分析，两组数据的比较采用两个独立样本比较的t检验，，以a=0.05为显著性检验标准。 结果： 1模型建立 B6SJL-BTg（SOD1~(G93A)）1Gur/J半合子雄鼠与B6SJLF1/J+/+雌鼠1:1杂交，在恒温、恒湿、12h光照/黑暗交替循环、无特殊病原菌的（Specificpathogen free， SPF）环境中，喂以灭菌的SPF级颗粒型鼠类饲料及灭菌水，经剪尾尖提取DNA、PCR扩增后、琼脂糖凝胶电泳结果示（Fig.1）：位于200-300bp之间的条带（236bp）为mSOD1的PCR产物，此种小鼠为SOD1~(G93A)转基因阳性小鼠。没有此条带为非mSOD1的PCR产物，为非SOD1~(G93A)转基因鼠。 2甲苯胺蓝染色 2.1上胸髓（T1-T3） 症状前期、发病期、终末期SOD1~(G93A)转基因小鼠中神经元计数分别为7.4±3.0、7.0±2.0、3.7±1.5，对照组分别为5.3±1.9、4.1±1.2、6.1±1.9，症状前期和发病期期较终末期比较均有显著性差别（P0.05）。发病期及终末期神经元计数较对照组有显著性差别（P0.05）。症状前期及发病期转基因鼠神经元大致正常，终末期神经元变性。 2.2中胸髓（T4-T6） SOD1~(G93A)转基因小鼠症状前期、发病期、终末期神经元计数分别为4.5±1.6、4.3±1.5、2.5±1.2，总体均数比较P=0.01(0.05）差别无显著性意义。对照组分别为4.1±2.0、4.5±2.0、5.5±1.6，终末期SOD1~(G93A)转基因小鼠神经元细胞计数较对照组有显著性差别（P0.05）。症状前期及发病期转基因鼠神经元大致正常，终末期神经元变性。 2.3下胸髓（T7-T9） SOD1~(G93A)转基因小鼠在症状前期、发病期、终末期神经元计数分别为4.4±1.6、5.0±1.8、2.4±0.8，对照组分别为5.0±2.0、4.4±1.2、5.5±1.6，症状前期和发病期较终末期比较均有显著性差别（P0.05）。终末期SOD1~(G93A)转基因小鼠神经元细胞计数较对照组有显著性差别（P0.05）。症状前期及发病期转基因鼠神经元大致正常，终末期神经元变性。 3免疫组化染色 3.1上胸髓（T1-T3） SOD1~(G93A)转基因小鼠症状前期、发病期、终末期神经元计数分别为6.5±1.2、6.0±2.0、3.7±1.2，对照组分别为5.8±1.9、7.8±1.5、5.0±1.0，症状前期和发病期较终末期比较均有差别（P0.05）。发病期神经元细胞计数较对照组有显著性差别（P0.05）。症状前期及发病期神经元包浆呈深褐色，胞核无色，成多边形。终末期神经元变性，着色变淡。 3.2中胸髓（T4-T6） SOD1~(G93A)转基因小鼠症状前期、发病期、终末期神经元计数分别为6.6±2.6、4.9±2.0、3.0±1.4，症状前期和发病期与终末比较均有差别（P0.05）。对照组分别为4.8±1.0、5.5±0.6、5.8±1.0，终末期神经元细胞计数较对照组有显著性差别（P0.05）。症状前期及发病期神经元包浆呈深褐色，胞核无色，成多边形。终末期神经元变性，着色变淡。 3.3下胸髓（T7-T9） SOD1~(G93A)转基因小鼠症状前期、发病期、终末期神经元计数分别为6.7±1.8、6.3±2.6、3.0±1.0，总体均数比较P=0.059(0.05）差别无显著性意义,对照组分别为5.3±1.2、5.3±1.5、5.0±0.0，终末期神经元细胞计数较对照组有显著性差别（P0.05）。症状前期及发病期神经元包浆呈深褐色，胞核无色，成多边形。终末期神经元变性，着色变淡。 结论：在SOD1转基因鼠发病过程中，存在脊髓侧角神经元丢失，尤其是在疾病的终末期，上、中、下胸髓节段间无明显差异。
[Abstract]:Objective: amyotrophic lateral sclerosis (amyotrophic lateral sclerosis, ALS) is a pathogeny unknown neurodegenerative disease, selectively damaging the cerebral cortex motoneurons, brainstem motor neurons, and a motoneurons in the anterior horn of the spinal cord, causing progressive muscle weakness, atrophy, and final death due to respiratory muscle paralysis. Recent research It was found that some ALS patients had the symptoms of the autonomic nervous system, extrapyramidal system, sensory system and other non motor nerve regions, suggesting that ALS may be a multi system neurodegenerative disease,.Murata Y found the changes in the circadian blood pressure in ALS, the correlation between blood pressure and heart rate decreased, and the circulation failure could be induced seriously. Arrhythmia and even sudden death [1], and other abnormalities of autonomic nerve, such as increased perspiration and reduction of [2], saliva secretion reduced [3], gastric emptying time extended [4] and other changes.
Takahashi H and Kennedy PG reported the loss of [5-6] in the middle lateral nucleus of the thoracic spinal cord of the patients with ALS, Itoh T found the changes in the immune activity of the neurons and the Kihira T also found the inclusion body [8] in the cytoplasm of the atrophic neurons. SOD1~ (G93A) transgenic mice have been found to have a significant loss of [9]. in the nucleus of the medulla oblongata and the medial lateral column. It is found that the heart rate of the early transgenic mice is higher in the quiet state, suggesting that the early autonomic nervous function damage of the disease is [10]..
The low-level center of the sympathetic nerve is located in the spinal thoracic 1 (T1) to the lumbar 2- waist 3 (L2 or L3), which constitutes the middle lateral column (IML), which plays an important role in regulating the function of the autonomic nerve.
In this experiment, we intend to use toluidine blue staining and immunohistochemical method to observe the structure of spinal cord neurons and the expression of acetylcholinesterase in the spinal cord side angle of SOD1~ (G93A) transgenic mice. The aim of this study is to explore the characteristics of the changes of the spinal cord neurons in the pathogenesis of ALS, which is ALS The study of pathogenesis provides a theoretical basis.
Method锛

本文编号：2015698