中国布氏菌的多位点序列分型研究

发布时间：2018-06-26 20:54

  本文选题：布氏菌 + 多位点序列分型　； 参考：《山西医科大学》2011年硕士论文

【摘要】：目的:在原有的7个管家基因和1个外膜蛋白的基础上,新增加Ⅳ型分泌系统中的两个毒力因子,利用多个管家基因的序列进行分型,建立一种适用于布氏菌的分辨率较高的ST分型方法,用于中国布氏菌分离株的分型,了解菌株的遗传特征及遗传进化关系,为我国布氏菌分子流行病学的研究提供依据。 方法:以PCR技术为基础,应用测序技术进行多位点序列分型(Multiple locus sequence typing,MLST)研究。选取1953年到2010年我国不同地区分离到的164株布氏菌分离株和3株疫苗株作为研究对象。通过对国际标准株的比较评价实验的真实性,用血清学、噬菌体等方法对164株分离株进行再次鉴定验证实验的可靠性。在此基础上对164株布氏菌分离株和3株疫苗株的10对目的基因的扩增产物进行测序,对比得到各目的基因的等位基因,从而判定其ST型,利用MLST在线工具(NRDB、LIAN、eBURST、Tree drawing),对序列的等位基因型、序列型分离、连锁平衡、聚类、进化树等进行分析,确定序列型、了解菌株间的进化关系。 结果: (1)以布氏菌属的17株国际标准菌株作为参照,结果显示:菌株的完全符合率为81.25%,等位基因的符合率为96.88%。有差别的为羊种菌63/9(cobQ)、牛种菌86/8/59(glk)、牛种菌Tulya(aroA)、绵羊附睾种菌5K33(omp25);经过血清学、噬菌体等方法对164株分离株进行复检,均与原始结果相一致。 (2)应用MLST分型方法将164株布氏菌和3株疫苗株共分为38个ST型,得到了38个ST型的等位基因谱,其中牛种菌分为13个型,羊种菌分为8个型,猪种菌分为11个型,犬种菌分为6个型,ST-37中既有猪种菌又有犬种菌;疫苗株S2被单独分为一个型。 (3)分析实验菌株等位基因多态性结果显示:omp25多态性变异程度最大,10个位点gap、aroA、glk、dnaK、gyrB、trpE、cobQ、omp25、VirB5和VirB8的遗传多态性分别为0.6612、0.7867、0.7286、0.5663、0.7035、0.4110、0.7114、0.8996、0.6659、0.5780。 (4)将38个ST进行分裂分解、N-J计算方法绘制进化树以及eBRUST分析,显示羊种菌和牛种菌各聚为一簇,犬种和猪种菌聚在一起。表明牛种、羊种的各自生物型在基因水平上是高度保守的,各自的种相对独立,具有更高的相似性,而猪种与犬种之间的亲缘关系相近。同时也提示,布氏菌的ST型太少,难分析出不同型间的变异关系,从另一方面表明,布氏菌是一个高度保守的细菌,ST型变异小。 结论: (1)选取了10个管家基因,初步建立了一种新的分类学方法,为建立中国布氏菌分离株的MLST数据库提供了丰富的数据资料。 (2)将菌株的生物型别与得到的ST型相比较,发现布氏菌的生物型与ST型之间无明显的相关性。MLST的分型结果进一步证实了犬种布氏菌不只是一个生物型。 (3)通过对等位基因谱的分析,发现特异性的SNP位点。牛种布氏菌(除Tulya外)为gap-2;羊种布氏菌中包括三个,即glk-3、trpE-5、VirB5-4;大部分猪种和犬种布氏菌共享的(除标准株猪种5型)dnaK-1。 (4)本研究所用的10个基因位点,依据其DNA序列进行分型,对未知分离株种的鉴定是一种有用的工具。
[Abstract]:Objective : On the basis of the original seven housekeeping genes and one outer membrane protein , the two virulence factors in the type 鈪，

本文编号：2071377