大鼠再生肝的陷窝细胞基因表达谱分析及其opn的作用研究

发布时间：2018-07-03 05:54

本文选题：肝再生 + 陷窝细胞　；参考：《河南师范大学》2011年博士论文

【摘要】：肝脏是人体的重要器官之一,其强大的再生能力亦为学者重视。人们通常以Higgins和Anderson建立的大鼠2/3肝切除手术诱导的再生肝组织材料为对象研究肝再生分子机理。但肝脏由多种细胞组成,肝再生中各种肝脏细胞的生理、生化活动显著不同,肝再生进程一般受到肝实质细胞和非实质细胞之间的信号协调支配。因此将再生肝的各种细胞分离出来分别进行研究,将会使研究结果更加明晰、简化。陷窝细胞(pit cell)是肝脏特异的自然杀伤细胞,不仅对肿瘤细胞和病毒感染的肝细胞有直接杀伤作用,还参与调控肝再生的程度。尽管关于陷窝细胞在肝脏重建方面的功能有所阐述,但目前缺乏转录水平上深入研究陷窝细胞与肝再生的具体关系的研究。为从基因转录水平系统研究陷窝细胞在肝再生中作用,本研究按Higgins等方法制作大鼠部分肝切除(partial hepatectomy,PH)模型,用两步灌流法分散肝脏细胞,用60%的percoll密度梯度离心和免疫磁珠分离肝陷窝细胞,用real-time RT-PCR定量陷窝细胞的CD8和CD56 mRNA,用蛋白免疫印迹方法定量陷窝细胞的CD8和CD56蛋白。初步证实,从PH后各时间点分离的肝陷窝细胞成活率均在96%以上,CD8和CD56阳性细胞占95%以上,CD8和CD56 mRNA量稳定,相应的蛋白量亦稳定。本文接着从分离得到的高活性、高纯度的陷窝细胞入手,用含11789个已知基因、13231个未知基因的Rat Genome 230 2.0芯片首次检测大鼠2/3肝切除后恢复10个时点的肝陷窝细胞基因表达谱,用real-time PCR验证芯片结果的可靠性,用生物信息学和系统生物学方法分析它们与大鼠肝再生的相关性。结果发现,共970个基因(包括612个已知基因和358个未知基因)与大鼠肝再生相关。聚类分析显示上述612个已知基因明显呈现上调和下调两种表达模式,k-means按照它们在肝再生中的表达异同细分为Cluster 1-8。GO分析显示上调基因和下调基因均主要涉及23种生理活动。根据大鼠再生肝陷窝细胞的基因表达模式和功能富集分析,发现陷窝细胞中的细胞因子、生长因子等活性物质的分泌及其参与的信号级联反应在肝再生启动阶段增强,肝陷窝细胞增殖主要在24-72h之间,免疫、炎症因子的基因转录及效应发挥主要发生在肝再生终止阶段,而陷窝细胞显然不承担创伤愈合和基础物质代谢的功能角色。其中,骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种活化淋巴细胞和巨噬细胞分泌的活性细胞因子,它的mRNA水平在2-72h再生肝陷窝细胞中显著上调,最高达是对照的31倍。应用Pathway Studio 7.0分析、建立陷窝细胞中肝再生相关基因之间的互作关系网发现,与OPN有关联的蛋白多达30多个,包括调节蛋白和靶蛋白,多种炎性疾病的发生与此基因互作网相关。说明OPN与再生肝的陷窝细胞密切相关。为阐明OPN对肝再生的影响,本研究克隆了opn基因,并构建了opn的表达载体pEGFP-N1-opn及其干涉载体pGenesil-1.0-opn(313)和pGenesil-1.0-opn(887),在此基础上继续构建了干涉载体对应的检验载体pGenesil-1.0-HK-opn、pGenesil-1.0-opn(313)-opn和pGenesil-1.0-opn(887)-opn。将各检验载体分别进行液压转基因,根据与OPN融合表达的绿色荧光蛋白阳性细胞率与对照相比的下降程度,判断pGenesil-1.0-opn(313)比pGenesil-1.0-opn(887)的干涉效果强烈。将表达载体和干涉载体分别进行液压转基因得出外源性基因或干涉片段的表达高峰时点,结合内源性opn在大鼠再生肝组织中PH后6-12h表达最高,依据使内源性和外源性opn的作用叠加的原则,选择于PH前30h转入表达载体,PH后0h转入干涉载体。通过对大鼠死亡率、表达动力学、组织形态结构、再生肝指数、肝再生率等方面的结果分析表明:转入opn表达载体后,炎症反应和肝损伤明显加剧。相反,干涉质粒pGenesil-1.0-opn(313)能显著降低肝系数和肝再生率,减少pcna, myc, bcl2, icam1, mmp2和tgfb1的表达量。综上所述,opn是肝再生相关基因,可能通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡,调节细胞外基质的合成而发挥增强肝再生作用。
[Abstract]:The liver is one of the most important organs of human body , and its powerful regeneration ability is also paid attention to by scholars . The liver regeneration process is usually controlled by the regeneration of liver tissue material induced by 2 / 3 hepatectomy in rats .

In order to study the role of lacunae cells in liver regeneration from gene transcription level system , the partial hepatectomy ( PH ) model was prepared by two - step perfusion method . CD8 and CD56 proteins were quantified by using a two - step perfusion method . The survival rates of CD8 and CD56 were quantified by means of a real - time RT - PCR method . The survival rates of CD8 and CD56 were more than 96 % , CD8 and CD56 positive cells were more than 95 % , and the amount of CD8 and CD56 mRNA was stable .

The results showed that 970 genes ( including 612 known genes and 358 unknown genes ) were associated with liver regeneration in rats . The results showed that 970 genes ( including 612 known genes and 358 unknown genes ) were associated with liver regeneration in rats .

In this study , osteolytic and osteolytic activity is an active cytokine secreted by activated lymphocytes and macrophages , and its mRNA level is up - regulated in 2 - 72 h of regenerated liver - trapping cells , up to 31 - fold higher than that of control .

The expression vector pGenesil - 1.0 - HK - opn , pGenesil - 1.0 - opn ( 313 ) - opn , pGenesil - 1.0 - opn ( 887 ) - opn ( pGenesil - 1.0 - opn ( 887 ) - opn ( pGenesil - 1.0 - opn ( 887 ) - opn was constructed .
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R346

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