淋球菌NspA重组蛋白诱导THP-1释放促炎细胞因子及细胞凋亡的作用

发布时间：2018-07-03 10:27

  本文选题：淋球菌 + 重组NspA　； 参考：《南华大学》2012年硕士论文

【摘要】：目的：构建pGEX-6p-1/nspA原核重组载体，表达并纯化GST-NspA重组蛋白，探讨NspA诱导人单核细胞（THP-1）产生炎性细胞因子IL-1β、TNF-α和HMGB1的潜在能力及其诱导THP-1细胞凋亡程度的影响。 方法：通过Genbank获取淋球菌NspA蛋白的基因序列，以WHO-E株全基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到目的片段，双酶切后连接到原核表达载体pGEX-6p-1质粒上，经测序鉴定后转化至表达宿主菌E.coli BL-21中，分别用IPTG浓度为0.2、0.5、0.8、1.0、1.2mmol/L，在不同温度下（13℃、20℃、25℃、30℃、37℃）诱导蛋白表达；采用SDS-PAGE分析和Western blot鉴定表达产物，GST-Bind树脂柱纯化重组蛋白，经BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度，用多粘菌素B去除纯化蛋白中的内毒素。以不同浓度NspA重组蛋白刺激THP-1分别作用不同的时长，采用ELISA法检测THP-1分泌促炎细胞因子HMGB1、IL-1β和TNF-α的水平。用不同浓度的NspA处理THP-1细胞，经AnnexinV-EGFP-PI双染法染色后，用荧光显微镜观测在不同刺激时间下的细胞凋亡形态上的变化，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 结果：PCR扩增出淋球菌WHO-E株NspA基因目的片段，构建pGEX-6p-1/nspA原核重组载体，经酶切和测序鉴定证实与GenBank上GI：215260662序列完全一致。在IPTG浓度为0.8mmol/L、25℃诱导4.5h可得到重组表达菌表达NspA可溶性蛋白的最佳状态，获得了相对分子量约为44kDa的重组蛋白，，选取菌体超声后的上清，经GST-Bind树脂柱亲和纯化后得到NspA纯化蛋白；经BCA试剂盒检测蛋白浓度为463μg/mL，经多粘菌素B处理重组蛋白去除内毒素后，鲎试验检测内毒素含量小于0.05EU/mL。2、4、8、16、32μg/mL的NspA重组蛋白均能诱导THP-1产生不同水平的IL-1β、TNF-α和HMGB1，并呈剂量依赖性，同时也随着刺激时长的增加而变化。NspA的刺激浓度在8μg/mL作用48h时，TNF-α的量达到138pg/mL的峰值，与PBS/GST对照组及其它各平行组之间比较均有显著差异(P0.05)。在NspA刺激浓度4μg/mL作用时长24h时、8μg/mL刺激48h时，IL-1β分别达到约56pg/mL的峰值，与PBS/GST对照组及其它各平行组之间比较均有显著差异(P0.05)。HMGB1的分泌量随时间的延长而增加，在NspA刺激60h时，HMGB1的分泌量达到峰值，与PBS/GST对照组及其它各平行组之间比较均有显著差异(P0.05)。用4、8、16、32、64μg/mL NspA重组蛋白刺激THP-1细胞作用不同的时间梯度，经AnnexinV-EGFP-PI双染法染色后荧光显微镜观察，随着作用时间的延长及蛋白刺激浓度的升高，凋亡的细胞明显增多。通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况，结果显示随着作用时间的延长及蛋白刺激浓度的升高，细胞凋亡百分率有明显的变化，在刺激蛋白浓度为16μg/mL作用24h的时候凋亡百分率达到峰值为18.27%，与PBS/GST对照组及其它各平行组比较均有显著差异(P0.05)。 结论： 1.成功构建了pGEX-6p-1/NspA原核表达载体，制备出可溶性的高纯度NspA重组蛋白。 2. NspA重组蛋白能促进THP-1细胞分泌炎症因子IL-lβ、TNF-α、HMGB1。 3. NspA重组蛋白能诱导THP-1细胞发生凋亡。
[Abstract]:Objective: to construct pGEX-6p-1/nspA Prokaryotic Recombinant Vector, express and purify GST-NspA recombinant protein, and explore the potential ability of NspA induced human mononuclear cells (THP-1) to produce inflammatory cytokines IL-1 beta, TNF- alpha and HMGB1 and the effect of inducing the degree of apoptosis of THP-1 cells.
Methods: the gene sequence of gonococcal NspA protein was obtained by Genbank, and the target fragment was amplified by PCR with the whole genome DNA of WHO-E strain. After double enzyme digestion, it was connected to the pGEX-6p-1 plasmid of the prokaryotic expression vector, and then transformed into E.coli BL-21 to express the host bacteria by sequencing, and the concentration of IPTG was 0.2,0.5,0.8,1.0,1.2mmol/L, respectively. The protein expression was induced at different temperatures (13, 20, 25, 30, 37). The expression products were identified by SDS-PAGE analysis and Western blot, the recombinant protein was purified by the GST-Bind resin column, the concentration of protein was determined by the BCA protein concentration detection kit and the endotoxin in the purified protein was removed by the polymyxin B. The recombinant protein was stimulated with different concentrations of NspA. THP-1 was used to determine the level of THP-1 secreting proinflammatory cytokines HMGB1, IL-1 beta and TNF- alpha by ELISA method respectively. THP-1 cells were treated with NspA with different concentrations. After dyeing with AnnexinV-EGFP-PI double staining, the morphological changes of apoptosis in different stimulation time were observed by fluorescence microscope, and the flow cytometry was used to detect the changes of cell apoptosis in different stimuli time. Cell apoptosis.
Results: the target fragment of NspA gene of gonococcus WHO-E strain was amplified by PCR, and the pGEX-6p-1/nspA prokaryotic recombinant vector was constructed. The GI:215260662 sequence on GenBank was confirmed by enzyme digestion and sequencing. The optimum state of the expression of NspA soluble protein expressed by recombinant expression bacteria was obtained at IPTG concentration as 0.8mmol/L, and at 25 degrees C, the relative expression of NspA soluble protein was obtained. The recombinant protein with a molecular weight of about 44kDa was selected to select the supernatant after the bacterial ultrasound, and the purified protein was purified by the affinity purification of the GST-Bind resin column. The concentration of the protein was 463 u g/mL by the BCA kit. After the recombinant protein was treated with the polymyxin B to remove the endotoxin, the lysate test detected the content of the endotoxin in NspA less than 0.05EU/mL.2,4,8,16,32 u g/mL. Histone can induce THP-1 to produce different levels of IL-1 beta, TNF- alpha and HMGB1, and it is dose-dependent. At the same time, the concentration of TNF- A is up to the peak of 138pg/mL when the stimulation concentration of.NspA is increased at 8 mu g/mL, and there are significant differences (P0.05) between the PBS/GST control group and the other parallel groups (P0.05). When the concentration of A was 4 mu g/mL for long 24h, when 8 g/mL stimulated 48h, IL-1 beta reached a peak of about 56pg/mL, and there was a significant difference between the PBS/GST control group and the other parallel groups (P0.05) the secretion of.HMGB1 increased with the prolongation of time. The comparison of the parallel groups was significantly different (P0.05). 4,8,16,32,64 micron NspA recombinant protein was used to stimulate the different time gradient of THP-1 cells, and the apoptotic cells were obviously increased with the prolongation of the action time and the increase of the concentration of protein stimulated by the AnnexinV-EGFP-PI double staining method. The flow cytometry was used. The results showed that the percentage of apoptosis was significantly changed with the prolongation of action time and the increase of protein stimulation concentration. The percentage of apoptosis reached a peak of 18.27% when the concentration of stimulant protein was 16 g/mL 24h, which was significantly different from that of the PBS/GST control group and its parallel groups (P0.05).
Conclusion:
1. the prokaryotic expression vector of pGEX-6p-1/NspA was successfully constructed, and soluble high purity NspA recombinant protein was prepared.
2. NspA recombinant protein can promote THP-1 cells to secrete inflammatory cytokines IL-l beta, TNF- alpha, HMGB1.
3. NspA recombinant protein can induce apoptosis in THP-1 cells.
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

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本文编号：2093334