重组人细胞角蛋白9 cDNA的原核表达及纯化

发布时间：2018-07-16 20:00

【摘要】：目的克隆人细胞角蛋白CK9的cDNA,通过原核表达系统表达融合蛋白并进行纯化和鉴定。方法从人角质形成细胞系(HaCaT)中提取RNA,以RT-PCR反转录cDNA,使用特异性引物PCR扩增出人CK9编码区全长并克隆到pET-28a载体上,再用IPTG诱导融合蛋白his-CK9的表达。表达的融合蛋白通过Ni 2+亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果测序鉴定构建表达载体中CK9的cDNA序列正确;融合蛋白his-CK9可在大肠杆菌中诱导表达;纯化的融合蛋白his-CK9纯度较高;纯化的融合蛋白his-CK9可与商品化CK9抗体特异性结合。结论成功构建原核表达载体pET-28a-CK9,并成功诱导及纯化融合蛋白his-CK9。
[Abstract]:Objective to clone the cDNAof human cytokeratin CK9 and express the fusion protein by prokaryotic expression system. Methods RNAs were extracted from human keratinocyte cell line (HaCaT) and reverse transcripted cDNA.Human CK9 coding region was amplified by specific primer PCR and cloned into pET-28a vector. The expression of fusion protein his-CK9 was induced by IPTG. The fusion protein was purified by Ni 2 affinity chromatography and identified by SDS-PAGE and Western blot. Results the cDNA sequence of CK9 was correct, the fusion protein his-CK9 could be expressed in Escherichia coli, the purified fusion protein his-CK9 was of high purity, and the purified fusion protein his-CK9 could specifically bind to commercial CK9 antibody. Conclusion the prokaryotic expression vector pET-28a-CK9 was successfully constructed and the fusion protein his-CK9 was successfully induced and purified.
【作者单位】： 西安交通大学第一附属医院转化医学中心;西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系;陕西省肿瘤精准医学重点实验室;西安交通大学第一附属医院皮肤科;西安交通大学医学部附属红会医院骨坏死与关节重建病区;西安交通大学第一附属医院骨科;西安交通大学第一附属医院消化内科;
【基金】：国家自然科学基金资助项目(No.81273211,81201373) 陕西省社会发展科技攻关项目(No.2016SF-238) 西安交通大学第一附属医院基金资助项目(No.2016QN-13)~~
【分类号】：R3416

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本文编号：2127518