小鼠脂肪干细胞分离培养及生物特性研究

发布时间：2018-07-18 13:03

【摘要】：脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)是脂肪组织中存在的一种成体干细胞,具有便于取材,可向三个胚层方向分化等优点。本实验主要研究ASCs的体外分离培养条件优化；ASCs向脂肪细胞、成骨细胞、精子细胞的诱导分化；Reversine对ASCs生物学特性的影响。 通过MTT、免疫组化及RT-PCR证明,分离培养的ASCs在35代内保持良好的生物学特性,P5、P15、P25细胞倍增时间分别为34.6h、37.8h、38.3h；持续表达细胞表面抗原CD29、CD44,不表达造血干细胞特异表面抗原CD45；表达特异性基因CD29、CD34、CD90、Sca-1、c-Myc,不表达Sox-2和Oct-4。说明本实验采用的ASCs的分离培养方法能够保持ASCs的未分化状态。 ASCs在成脂诱导剂诱导下分化为脂肪细胞,诱导第六天油红O染色计算P5ASCs诱导率为78.3%±9.2%,P15ASCs诱导率为73.9%±8.7%,P25ASCs诱导率为67.0%±1.52%,不同代数间诱导率无显著性差异；在成骨诱导剂诱导下分化为成骨细胞,第11天进行茜素红染色,钙结节被染成深红色,放大100倍视野下计数被染色的钙结节数量,P5ASCs为15±2.4个,P15ASCs为13±3.6个,不同代数之间无显著性差异；P5ASCs与睾丸组织共培养,10天后RT-PCR结果显示表达精子细胞特异基因Prml、Acr。 Reversine终浓度大于5μmol/L时对ASCs有明显的细胞毒性,浓度为1μmol/L时,对ASCs的增殖率无明显影响,但可以显著增加ASCs向脂肪细胞,成骨细胞诱导分化的效率。 本实验建立了ASCs分离培养体系,ASCs可以在此体系内长期培养并保持良好的生物学特性：证明了ASCs具有在适当诱导条件下向脂肪细胞、成骨细胞以及精子细胞分化的潜能；同时证明了reversine可以提高ASCs向脂肪细胞、成骨细胞分化的转分化率,是一种有效的提高ASCs分化潜能的小分子。
[Abstract]:Adipose-derived stem cells are one of the adult stem cells in adipose tissue. The aim of this study was to study the effects of Reversine on the biological characteristics of ASCs by optimizing the differentiation of ASCs into adipocytes, osteoblasts and sperm cells in vitro. The results of MTT, immunohistochemistry and RT-PCR showed that the biological characteristics of ASCs isolated and cultured were 34.6 h / 37.8 h and 38.3 h, respectively, and the cell surface antigen CD29 + CD44 was not expressed in vitro, and the specific surface antigen CD45 was not expressed in the cultured ASCs during the 35 passages, and the doubling time of P5 / P15 / P25 cells was 37.6 h / 37.8 h and 38.3 h / 38.3 h, respectively. The specific gene CD29, CD34, CD90, Sca-1, c-Myc, did not express Sox-2 and Oct-4. The results showed that the ASCs isolated and cultured in this experiment could maintain the undifferentiated state of ASCs. ASCs differentiated into adipocytes induced by adipogenic inducer. On the sixth day of induction, the induction rate of P5ASCs by oil red O staining was 78.3% 卤9.2% and that of P15ASCs was 73.9% 卤8.7%. The induction rate of P25ASCs was 67.0% 卤1.522.There was no significant difference between different generations, the osteoblasts differentiated into osteoblasts induced by osteogenic inducers, and alizarin red staining was performed on the 11th day. The number of P5ASCs was 15 卤2.4 and P15ASCs were 13 卤3.6. There was no significant difference between different algebras. After 10 days of co-culture of P5ASCs with testicular tissue, RT-PCR results showed that the final concentration of PrmlAcr.Reversine expressing spermatocyte specific gene was more than 5 渭 mol / L, which had obvious cytotoxicity to ASCs, and when the concentration was 1 渭 mol / L, the proliferation rate of ASCs was not significantly affected. But it can significantly increase the efficiency of ASCs induced differentiation into adipocytes and osteoblasts. In this experiment, the ASCs isolation and culture system can be cultured in this system for a long time and maintain good biological characteristics. It is proved that ASCs have the potential to differentiate into adipocytes, osteoblasts and sperm cells under suitable induction conditions. At the same time, it is proved that reversine can increase the transdifferentiation rate of adipocytes and osteoblasts, and it is an effective small molecule to improve the differentiation potential of ASCs.
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

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本文编号：2131984