LSECtin正调控LPS诱导的TLR4信号通路及其免疫效应

发布时间：2018-08-08 13:57

【摘要】：从低等生物开始,C型凝集素受体(CLRs)作为一类重要的模式识别受体(PRRs)就一直发挥着识别病原体、抵抗感染的作用。有的C型凝集素可直接诱导胞内信号传导,激活NF-κB通路,导致炎症细胞因子的产生。值得关注的是还有很多C型凝集素通过多种途径协同或拮抗Toll样受体(TLRs)信号,诱导免疫反应抵抗微生物感染;或干扰TLRs信号转导,导致微生物免疫逃逸。 肝窦内皮细胞C型凝集素分子LSECtin是本实验室刘万里博士等人在国际上率先克隆并研究的一种新型凝集素分子。与已知的凝集素分子DC-SIGN、DC-SIGNR和CD23属于同一家族,共属于C型凝集素超家族。该家族成员DC-SIGN作为病原微生物识别受体,通过直接诱导胞内信号或通过调控TLRs胞内信号,在微生物感染与免疫方面发挥重要的功能。我们推测LSECtin作为一种新的CLRs,很可能在机体先天免疫反应中扮演重要角色。 本文中我们揭示:(1)LSECtin是一种新的细菌识别分子:通过细菌粘附实验,我们证实LSECtin可以与大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏杆菌结合,并且可以被Ca2+的螯合剂EGTA所抑制。由于大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏杆菌都是革兰氏阴性菌,革兰氏阴性菌的主要成分都是脂多糖(LPS),因此我们推测LSECtin可能与脂多糖LPS存在相互作用,并在LPS介导的信号通路及其免疫反应中发挥功能。(2)LSECtin表达于巨噬细胞:通过PCR检测,证实LSECtin表达于小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞和骨髓来源的小鼠原代巨噬细胞(BMMφ);在LPS刺激的条件下,LSECtin的表达上调。(3)LSECtin正调控LPS诱导的TLR4信号通路及其免疫效应:在整体水平上,在LPS诱导的小鼠休克模型中,与WT小鼠相比,LSECtin-/-小鼠体内炎症细胞因子分泌明显减少、肺脏的损伤明显减轻、小鼠死亡率明显下降。在细胞水平上,敲低RAW264.7内LSECtin的表达后,LPS诱导的RAW264.7细胞分泌炎症细胞因子明显下降;敲除BMMφ内的LSECtin,LPS诱导的BMMφ分泌炎症细胞因子分泌也明显下降。在分子水平上,在LPS刺激的条件下,敲低LSECtin导致RAW264.7内的IκB的降解减慢以及p38和JNK1/2的磷酸化水平下降;敲除LSECtin导致BMMφ内的IκB的降解减慢以及p38和JNK1/2的磷酸化水平下降;相反,过表达LSECtin导致IκB降解加快以及p38和JNK1/2的磷酸化水平增强。(4)LSECtin促进TLR4在巨噬细胞表面的定位,上调其接头分子MyD88的募集,从而调控NF-κB信号通路及其免疫效应分子的产生:我们通过免疫共沉淀实验证明了LSECtin通过其CRD功能结构域与TLR4、CD14和MD-2发生相互作用。进而我们证实在LPS刺激的条件下,与WT BMMφ相比,LSECtin-/-BMMφ表达的TLR4的比例以及平均荧光强度均明显下降,表明LSECtin促进TLR4在BMMφ表面的定位。在LPS刺激的条件下,敲低LSECtin导致RAW264.7内MyD88的表达下降,敲除LSECtin导致BMMφ内MyD88的表达下降;相反,过表达LSECtin上调MyD88的表达。因此,LSECtin促进了MyD88接头分子的募集。(5) LSECtin可能以膜形式而非可溶形式发挥功能:我们有趣的发现在LSECtin敲除的BMMφ中加入可溶性LSECtin蛋白不能挽救因LSECtin缺失导致的细胞因子分泌减少;LSECtin可溶性蛋白也不能逆转LSECtin缺失导致的小鼠休克死亡率下降。因此可推测LSECtin自身必须锚定在膜上,才能促进TLR4的定位。 综上所述,本文揭示LSECtin作为一种C型凝集素分子,可正调控LPS诱导的TLR4信号通路及其免疫效应。
[Abstract]:Starting from lower organisms, C type lectin receptor (CLRs), as an important type of pattern recognition receptor (PRRs), has been playing the role of identifying pathogens and resisting infection. Some C lectin can directly induce intracellular signal conduction, activate NF- kappa B pathway, and lead to the production of inflammatory cytokines. There are many C agglutinin. The Toll - like receptor (TLRs) signal is synergized or antagonized by a variety of pathways, inducing immune response to resistance to microbial infection, or interfering with TLRs signal transduction, leading to the escape of microorganism immunity.
The C lectin molecule LSECtin of the hepatic sinusoidal endothelial cells is a new lectin molecule, which was first cloned and studied by Dr. Liu Wanli and others in the laboratory. It belongs to the same family with the known lectin molecules, DC-SIGN, DC-SIGNR and CD23, and belongs to the C type lectin superfamily. The family member DC-SIGN is recognized as a pathogenic microorganism. Body, by direct induction of intracellular signals or by regulating TLRs intracellular signals, plays an important role in microbial infection and immunity. We speculate that LSECtin, as a new CLRs, is likely to play an important role in the body's innate immune response.
In this article we reveal: (1) LSECtin is a new type of bacterial recognition molecule: by bacterial adhesion experiments, we have confirmed that LSECtin can be combined with Escherichia coli and Salmonella typhimurium and can be suppressed by the Ca2+ chelating agent EGTA. The main components are lipopolysaccharide (LPS), so we speculate that LSECtin may interact with lipopolysaccharide LPS and play a role in the LPS mediated signaling pathway and its immune response. (2) LSECtin is expressed in macrophages: LSECtin is expressed in mouse macrophage RAW264.7 cells and bone marrow derived mice by PCR detection. On the condition of LPS stimulation, the expression of LSECtin was up regulated. (3) LSECtin regulates the TLR4 signaling pathway induced by LPS and its immune effect: on the whole level, in the mouse shock model induced by LPS, the secretion of inflammatory cytokines in the LSECtin-/- mice is significantly reduced and the lung damage is obviously reduced, compared with WT mice. The death rate of mice decreased significantly. At the cell level, the expression of LSECtin in the low RAW264.7, the secretion of inflammatory cytokines induced by LPS induced RAW264.7 cells decreased obviously; the LSECtin in BMM [Phi], the secretion of inflammatory cytokines secreted by LPS induced BMM [Phi] also decreased obviously. In the molecular water, the low LSECtin led to R under the condition of LPS stimulation. The degradation of I kappa B in AW264.7 and the decrease of phosphorylation of p38 and JNK1/2; knockout LSECtin leading to the degradation of I kappa B in BMM and the decline in the phosphorylation level of p38 and JNK1/2; on the contrary, overexpression LSECtin leads to accelerated degradation and enhancement of phosphorylation. (4) promote the surface of macrophages. Localization, up-regulation the recruitment of its joint molecule MyD88, thus regulating the production of NF- kappa B signaling pathway and its immune effector molecules: we have demonstrated that LSECtin interaction with TLR4, CD14 and MD-2 through its CRD functional domain by immunoprecipitation experiments. Further we confirm that, under the condition of LPS stimulation, LSECtin-/-BMM [LSECtin-/-BMM] is compared with WT BMM. The ratio of the expression of TLR4 and the average fluorescence intensity decreased obviously, indicating that LSECtin promoted the localization of TLR4 on the surface of BMM phi. Under the condition of LPS stimulation, the expression of MyD88 in RAW264.7 decreased and the expression of LSECtin led to MyD88 in BMM. The recruitment of MyD88 connector molecules. (5) LSECtin may be functional in the form of membrane and not in soluble form: We interesting to find that the addition of soluble LSECtin protein in the BMM phi of LSECtin knockout can not save the decrease of cytokine secretion due to LSECtin deletion, and LSECtin soluble egg white can not reverse the shock induced by LSECtin deletion in mice. Therefore, it is possible to speculate that LSECtin itself must be anchored on the membrane to promote TLR4 localization.
In conclusion, LSECtin, as a C-type lectin molecule, can positively regulate LPS-induced TLR4 signaling pathway and its immune effect.
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

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本文编号：2172001