缺氧环境下BMSCs促进VECs增殖和血管形成

发布时间：2018-08-13 15:40

【摘要】：目的： 观察成人骨髓间充质干细胞在体外缺氧环境下对人脐静脉内皮细胞增殖和血管形成能力的影响并探讨其可能机制，为干细胞更好的应用于临床上缺血缺氧性疾病的治疗提供理论依据。 方法： 收集成人骨髓血，密度梯度离心法收集分离BMSCs并进行体外扩增培养，传至第4代用于实验；流式细胞技术鉴定BMSCs表面标志物。 收集BMSCs常氧环境(氧浓度为21%)下培养24h和缺氧环境下(含1%O2，5%CO2和94%N2的混合气体环境)培养24h后的细胞上清液即条件培养基。HUVECs传代培养后分成3组进行实验：对照组、 BMSCsCMN-HUVECs组和BMSCsCMH-HUVECs组，各实验组细胞于缺氧环境下用含不同条件培养基的培养液培养，体外血管形成实验分析3组HUVECs在Matrigel上管腔样结构形成情况，并进行量化比较；MTT检测3组HUVECs增殖能力。 BMSCs在缺氧环境下培养0h、12h、24h和48h后，RT-PCR检测细胞内SDF-1和VEGF的基因表达情况，0h为对照组，12h、24h和48h为实验组；ELISA法检测细胞上清液中SDF-1和VEGF的蛋白含量。 结果： 1.人BMSCs传至第4代呈漩涡状长梭形即纤维母细胞样生长；对数生长期的HUVECs多为多角形或短梭形，呈”铺路石”样排列生长 2.人BMSCs阳性表达CD29、CD44和CD90，而阴性表达CD34、CD45和CD106 3. BMSCsCMH-HUVECs组管腔样结构多于对照组和BMSCsCMN-HUVECs组。[14±2.3与3±0.59；14±2.3与5±1.1，P＜0.05] 4.不同缺氧时间点(12h，24h和48h)BMSCsCMH-HUVECs组细胞增殖能力均显著高于对照组和BMSCsCMN-HUVECs组。[0.54±0.053与0.33±0.041，0.68±0.091与0.42±0.048，0.72±0.106与0.49±0.074；0.54±0.053与0.31±0.041，0.68±0.091与0.43±0.071，0.72±0.106与0.51±0.086，P＜0.05] 5.不同缺氧时间点(12h，24h和48h)BMSCs的SDF-1和VEGF基因表达水平均显著高于对照组。[VEGF：0.718±0.048vs0.532±0.081，0.922±0.104vs0.532±0.081，0.843±0.092vs0.532±0.081；SDF-1：0.569±0.091vs0.361±0.035，0.701±0.046vs0.361±0.035，0.695±0.074vs0.361±0.035，P＜0.05] 6. BMSCsCMH中SDF-1和VEGF蛋白含量均明显高于BMSCsCMN。[SDF-1：(4.52±0.44)ng/106cells与(1.37±0.09) ng/106cells；VEGF：(7.94±0.89) ng/106cell与(2.75±0.23) ng/106cells，P＜0.05]。 结论： 1.缺氧环境下收集的条件培养基即BMSCsCMH显著提高HUVECs增殖和在Matrigel上管腔样结构形成能力； 2.缺氧显著上调BMSCs的SDF-1和VEGF基因表达，，并促进二者大量分泌至细胞上清液中发挥作用； 3.成人BMSCs在缺氧环境下通过旁分泌SDF-1和VEGF提高血管内皮细胞增殖活性和管腔样结构形成能力，促进血管新生。
[Abstract]:Aim: to investigate the effects of adult bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) on the proliferation and angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) under hypoxia in vitro and to explore its possible mechanism. To provide a theoretical basis for the better application of stem cells in the treatment of ischemic and hypoxic diseases. Methods: adult bone marrow blood was collected, BMSCs was isolated by density gradient centrifugation and cultured in vitro, then transmitted to the 4th passage for experiment. Flow cytometry was used to identify the surface markers of BMSCs. The supernatant of BMSCs cells cultured in normoxic environment (21% oxygen concentration) and hypoxic environment (containing 1O2 / 5CO2 and 94%N2 mixed gas) for 24 hours was divided into three groups: control group, BMSCsCMN-HUVECs group and BMSCsCMH-HUVECs group. The cells of each experimental group were cultured in anoxic medium with different conditioned media. In vitro angiogenesis experiment was conducted to analyze the formation of HUVECs in the lumen of Matrigel and to compare it quantitatively. MTT was used to detect the proliferative ability of HUVECs in the three groups. The expression of SDF-1 and VEGF genes in the cells were detected by RT-PCR for 24 h and 48 h after cultured in hypoxic environment for 12 h and 48 h respectively. The protein levels of SDF-1 and VEGF in the supernatant of the cells were detected by Elisa for 12 h and 48 h in the control group respectively. Results: 1. In the fourth generation, human BMSCs grew like fibroblasts, and HUVECs in logarithmic growth period was polygonal or short fusiform, and grew like "paving stone". Human BMSCs was positive for CD29, CD44 and CD90, but negative for CD34, CD45 and CD106. The lumen like structure of BMSCsCMH-HUVECs group was more than that of control group and BMSCsCMN-HUVECs group. [14 卤2.3 vs 3 卤0.59n14 卤2.3 vs 5 卤1.1 P < 0. 05] 4. The proliferative ability of BMSCsCMH-HUVECs group was significantly higher than that of control group and BMSCsCMN-HUVECs group at 12h and 48h. [0.54 卤0.053 vs 0.33 卤0.041 卤0.68 卤0.091 vs 0.42 卤0.048 卤0.72 卤0.106 and 0.49 卤0.074 卤0.54 卤0.053 vs 0.31 卤0.041 0.68 卤0.091 vs 0.43 卤0.071 卤0.72 卤0.106 and 0.51 卤0.086U P < 0. 05] 5. The expression of SDF-1 and VEGF gene in BMSCs at different hypoxia time points (12h, 24h and 48h) was significantly higher than that in control group. [VEGF:0.718 卤0.048vs0.532 卤0.081 卤0.922 卤0.104vs0.532 卤0.081 卤0.843 卤0.081]. SDF-1: 0.569 卤0.091vs0.361 卤0.035 卤0.701 卤0.046vs0.361 卤0.030.695 卤0.074vs0.361 卤0.035 (P < 0. 05). The protein contents of SDF-1 and VEGF in BMSCsCMH were significantly higher than those in BMSCsCMNs. [SDF-1: (4.52 卤0.44) ng/106cells and (1.37 卤0.09) ng / 106 cells: (7.94 卤0.89) ng/106cell and (2.75 卤0.23) ng / 106 cells P < 0.05]. Conclusion: 1. The conditioned culture medium (BMSCsCMH) collected in anoxic environment significantly increased the proliferation of HUVECs and the ability of forming lumen structure on Matrigel. 2. Hypoxia significantly upregulated the expression of SDF-1 and VEGF genes in BMSCs and promoted their secretion into the supernatant of cells. Adult BMSCs promotes angiogenesis by paracrine SDF-1 and VEGF in hypoxic environment.
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

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本文编号：2181427