人源性饲养层支持人胚胎干细胞生长情况的初步探讨

发布时间：2018-08-13 17:44

【摘要】：目的：初步探讨人源性饲养层支持人胚胎干细胞的生长情况；初步探讨人源性和鼠源性饲养层细胞分泌的bFGF与支持hESCs生长是否存在相关性。 方法：1本试验利用酶制剂消化法和微量液体组织块贴壁法原代分离培养包皮,睾丸组织,减胎组织,胎儿皮肤、肌肉、肺组织成纤维细胞,进行常规培养传代、冷冻复苏,通过接触抑制和解除抑制研究细胞的增殖潜力,通过免疫荧光法对其进行鉴定；2将人源性成纤维细胞制备成饲养层,同期接种同一株hESCs在人源性饲养层上,对比hESCs的贴壁率、克隆生长率及未分化率,比较它们支持hESCs生长的差异；3本试验通过ELISA方法,检测评估人源性和鼠源性细胞分泌的bFGF,对饲养层分泌的bFGF和支持hESCs增殖和不分化生长进行初步分析。数据采用SPSS 13.0软件包处理。计量资料以均数±标准差(X±S)表示,采用方差齐性检验和单因素组间方差分析比较各实验组之间的差异,检验水准a=0.05。 结果：1已成功分离包皮真皮成纤维细胞,睾丸组织成纤维细胞,减胎组织成纤维细胞,引产胎儿皮肤、肌肉、肺组织成纤维细胞,在体外能稳定培养、传代和冷冻、冷冻复苏和接触抑制解除后可以正常培养和传代。免疫荧光鉴定细胞波形蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性,再结合其分离时的组织来源,细胞生长的特点及细胞形态,证实其均为成纤维细胞。本试验比较了人源性饲养层支持hESCs生长的情况,排序为：包皮-胎肺-胎肌-胎皮-睾丸-减胎。传三代减胎组织培养hESCs的未分化率均最低。 2本试验发现鼠源性饲养层不能分泌任何可测量到的bFGF(敏感度0.22pg/mL),而人源性饲养层细胞均能分泌bFGF,包皮和减胎组织成纤维细胞在接种后6h就可以测到bFGF的分泌量,减胎组织成纤维细胞在接种24h和3d分泌的bFGF量均最高,包皮分泌的bFGF量均最低,且包皮、胎皮、胎肺24h和3d分泌bFGF量的差异无统计学意义。 结论：1本试验建立了包皮真皮成纤维细胞系,睾丸组织成纤维细胞系,减胎组织成纤维细胞系,胎儿肺组织成纤维细胞系各2株；胎儿皮肤、肌肉组织成纤维细胞系各1株。冻存了大量传代细胞以备用。 2人源性饲养层在一定程度上可以支持hESCs的生长,包皮成纤维细胞是一种值得推荐的饲养层细胞,但是在鼠源性饲养层上培养的hESCs未分化率高于人源性。 3丝裂霉素处理不会抑制人源性饲养层细胞分泌的bFGF量。bFGF是促进hESCs贴壁和增殖生长的重要因子,饲养层细胞自身分泌的bFGF能支持hESCs的贴壁和增殖生长,但不同饲养层支持hESCs生长的最适宜bFGF浓度和抑制hESCs分化的作用机制,还有待于进一步研究。
[Abstract]:Aim: to investigate the relationship between the bFGF secreted by human and mouse feeder cells and the growth of human embryonic stem cells (hESCs). Methods the fibroblasts of prepuce, testicular tissue, fetal skin, muscle and lung were isolated and cultured by enzyme digestion method and microliquid tissue adherence method. The proliferation potential of human fibroblasts was studied by contact inhibition and release inhibition. Human fibroblasts were prepared into feeder layer by immunofluorescence method. At the same time, the same strain of hESCs was inoculated on the homogenous feeder layer, and the adherence rate of hESCs was compared. Clone growth rate and undifferentiated rate were compared to compare their differences in support of hESCs growth. 3. ELISA method was used in this experiment. BFGFs secreted by human and mouse derived cells were detected, and the bFGF secreted by feeder layer and those supporting hESCs proliferation and undifferentiated growth were analyzed. The data were processed by SPSS 13.0 software package. The measurement data were expressed as mean 卤standard deviation (X 卤S). The differences among the experimental groups were compared by using the homogeneity test of variance and the analysis of variance among the single factor groups. Results the fibroblasts of prepuce dermis, testicular tissue, reduced fetal tissue, fetal skin, muscle and lung could be cultured, subcultured and frozen in vitro. Cryopresuscitation and contact inhibition can be cultured and subcultured normally. Positive expression of vimentin and negative expression of keratin were identified by immunofluorescence. Combined with the source of tissue, the characteristics of cell growth and cell morphology, it was confirmed that the cells were fibroblasts. In this experiment, the human feeder layer supported hESCs growth in the order of prepuce-fetal lung-fetal muscle-fetal skin-testis-reduced fetus. The undifferentiated rate of hESCs was the lowest in the third generation of reduced fetal tissue culture. 2 it was found that the murine feeder layer could not secrete any detectable bFGF (sensitive 0.22pg/mL), while the human derived feeder layer cells could secrete bFGFs, prepuce and pericardium. The amount of bFGF secreted by fibroblasts was measured 6 hours after inoculation. The amount of bFGF secreted by fibroblasts was the highest at 24 hours and 3 days after inoculation, and the bFGF secreted by prepuce was the lowest. There was no significant difference in the amount of bFGF secreted by prepuce, 24 h and 3 d of fetal lung. Conclusion the cell lines of prepuce dermis fibroblast testicular tissue fibroblast fetal lung fibroblast and fetal skin and muscle fibroblast were established in this experiment. Cryopreserved a large number of passage cells to reserve. 2 human feeder layers can support the growth of hESCs to some extent, prepuce fibroblasts are a kind of recommended feeder layer cells, However, the undifferentiated rate of hESCs cultured on murine feeder was higher than that of human. 3 the amount of bFGF produced by mitomycin could not inhibit the secretion of bFGF. BFGF was an important factor to promote the adhesion and proliferation of hESCs. The bFGF secreted by feeder cells can support the adhesion and proliferation of hESCs, but the optimal concentration of bFGF and the mechanism of inhibiting the differentiation of hESCs in different feeder layers need to be further studied.
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

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本文编号：2181723