真核表达质粒PIRES-Ag85B的构建及其在CHO细胞中的表达

发布时间：2018-08-15 15:40

【摘要】：目的：构建真核表达质粒PIRES-Ag85B,通过酶切鉴定和测序鉴定后在CHO细胞中进行表达,并用Western-blot检测表达结果,为开发新型的结核病疫苗和结核病血清免疫诊断试剂奠定基础。 方法：根据GenBank上结核分枝杆菌Ag85B基因的CDS序列,应用primer premier5.0设计一对引物,分别在引物5’端引入Nhe I和EcoR I酶切位点及保护碱基。从结核分枝杆菌标准株H37Rv中提取基因组DNA,应用引物,扩增Ag85B基因片段,用PCR回收试剂盒割胶回收后纯化PCR产物,双酶切PCR产物及真核表达质粒PIRES,经T4DNA连接酶连接后转化DH5α感受态细胞,用氨苄青霉素筛选阳性克隆后,再经PCR,双酶切和测序进行鉴定。应用脂质体转染技术,将重组质粒PIRES-Ag85B转染CHO细胞,48小时后用G418进行筛选,并用Western blot检测Ag85B的基因表达。 结果：从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增出978bp的Ag85B基因,并成功构建真核表达质粒PIRES-Ag85B,经Nhe I和EcoR I双酶切后电泳获得61,000bp和978bp的条带,与预期结果一致,经测序证实获得目的基因序列与GenBank公布的一致,转染CHO细胞后获得稳定表达Ag85B的CHO细胞株,用Western blot方法在蛋白水平检测Ag85B的基因表达。 结论：1从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Ag85B基因片段并成功构建真核表达质粒PIRES-Ag85B。2 Ag85B目基因在CHO细胞中获得表达。 图：14表：1参：49
[Abstract]:Objective: to construct the eukaryotic expression plasmid PIRES-Ag85B and express it in CHO cells by restriction endonuclease digestion and sequencing, and to establish the foundation for the development of new TB vaccine and tuberculosis serum immunological diagnostic reagent. Methods: according to the CDS sequence of Ag85B gene of Mycobacterium tuberculosis on GenBank, primer premier5.0 was used to design a pair of primers. Nhe I and EcoR I restriction sites and protective bases were introduced into the 5 'end of the primers, respectively. Genomic DNA was extracted from the standard strain of Mycobacterium tuberculosis (H37Rv). The Ag85B gene fragment was amplified by primers, and the PCR product was purified by PCR recovery kit. The PCR products and eukaryotic expression plasmid PIRESwere digested by double enzyme, and then transformed into DH5 伪 competent cells by T4DNA ligase. The positive clones were screened by ampicillin, then identified by PCR, double enzyme digestion and sequencing. The recombinant plasmid PIRES-Ag85B was transfected into CHO cells for 48 hours by liposome transfection and then screened by G418. The gene expression of Ag85B was detected by Western blot. Results: the Ag85B gene of 978bp was amplified from the genomic DNA of Mycobacterium tuberculosis standard strain H37Rv, and the eukaryotic expression plasmid PIRES-Ag85B was successfully constructed. The bands of 61000bp and 978bp were obtained by Nhe I and EcoR I double enzyme digestion electrophoresis. It was confirmed by sequencing that the sequence of the target gene was consistent with that published by GenBank. After transfection into CHO cells, stable CHO cell lines expressing Ag85B were obtained. Western blot method was used to detect the expression of Ag85B gene at the protein level. Conclusion the Ag85B gene fragment was amplified from the H37Rv genome of Mycobacterium tuberculosis and the eukaryotic expression plasmid PIRES-Ag85B.2 Ag85B order gene was successfully constructed and expressed in CHO cells. Fig. 14 Table 1 refs: 49
【学位授予单位】：安徽理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392.9

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本文编号：2184655