不同途径移植骨髓间充质干细胞治疗肝硬化及相关机制研究

发布时间：2018-10-08 14:28

【摘要】：研究背景与目的：终末期肝病严重危害人类健康,肝移植被认为是治疗终末期肝病最有效的方法,但因肝源、费用及抗排斥药物的不良反应等问题受到限制。干细胞移植治疗终末期肝病作为一种新方法显示出良好的应用前景。骨髓问充质干细胞(BMSCs)具有极强的自我复制能力和多向分化潜能,且低免疫源性,有望成为治疗终末期肝病的一种新型种子细胞。目前实验研究认为BMSCs参与受损肝组织的修复,但机制尚不明确,是否为多数研究者认为的干细胞跨胚层分化?目前国内外已有研究将干细胞移植治疗终末期肝病应用于临床,获得了一定疗效,但目前移植效率的问题,如移植途径是否影响移植效率,目前尚不清楚。因此本课题基上述两个问题,将采用体外诱导实验明确BMSCs是否可向肝样细胞分化,为体内干细胞移植治疗肝病终末期提供实验依据。借助动物模型经门静脉、外周静脉移植BMSCs,分析其定植情况及对肝功能的影响,明确两途径对干细胞治疗肝病疗效的影响,为临床研究提供实验基础。方法：(1)本研究采用密度梯度离心法和贴壁细胞联合培养法分离骨髓间充质干细胞,经培养传代获得纯化的BMSCs。(2)将纯化后的BMSCs在肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor HGF)和成纤维生长因子-4(basic fibroblast factor FGF-4)的作用下进行诱导培养后,免疫细胞化学检测肝细胞表面标志物白蛋白、甲胎蛋白、角蛋白18的表达,明确BMSCs是否可分化为肝样细胞。(3)将CC14轮替注射大鼠四肢内侧皮下,建造肝硬化大鼠模型。将GFP标记后的BMSCs经外周静脉、门静脉移植入肝硬化模型大鼠体内,荧光显微镜检测干细胞在肝内的定植情况,检测血清肝功能及免疫组化检测肝组织白蛋白的表达情况。结果：(1)采用密度梯度离心法和贴壁细胞联合培养法分离的骨髓间充质干细胞纯度高,体外培养增殖能力活跃。(2)大鼠骨髓间充质干细胞经HGF和FGF-4共诱导培养共28天,分别在14天、21天、28天免疫细胞化学检测肝细胞标志物。随着诱导时间延长,白蛋白及角蛋白18表达阳性率逐渐增加,甲胎蛋白表达逐渐降低。未诱导组白蛋白、角蛋白、甲胎蛋白表达阴性。(3)HE及Masson染色显示肝硬化大鼠模型建立成功。体外分离培养的骨髓间充质干细胞,经携带绿色荧光蛋白的慢病毒转染后在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达。经门静脉及外周静脉移植BMSCs28天后,两移植组大鼠肝脏组织切片均可见散在的绿色荧光蛋白阳性细胞,表明BMSCs移植后能定植于肝硬化大鼠模型体内。实验组各肝功能指标ALB、ALT、AST均随时间变化逐渐好转,门静脉实验组与其对照组比较各肝功能指标差异均有统计学意义,尾静脉实验组与其对照组比较各肝功能指标差异均有统计学意义,两实验组之间比较各肝功能指标差异均无统计学意义。免疫组化检测肝组织白蛋白表达,门静脉实验组与其对照组比较差异有统计学意义,尾静脉实验组和对照组比较差异有统计学意义,两实验组之间比较差异无统计学意义。结论： 1.骨髓间充质干细胞在体外可分化成为肝样细胞； 2.经尾静脉、门静脉移植的骨髓间充质干细胞能定植于大鼠受损的肝脏内,骨髓间充质干细胞移植可在一定程度上改善肝功能； 3.尾静脉、门静脉移植干细胞治疗肝病的效率无差别。
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【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

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