海马依赖性情节记忆调控的突触和神经环路机制研究

发布时间：2018-10-29 10:33

【摘要】：[背景]情感和学习记忆是认知功能的核心,学习和记忆是所有认知功能的基础。海马是与学习记忆密切相关的脑区,其功能受到外部与其有着直接或间接纤维支配的神经元及海马内部神经环路的影响。研究表明,与情绪密切相关的脑区杏仁核有直接纤维投射至海马并形成单突触联系,然而情绪对海马依赖性空间情节学习记忆的影响及相关分子机制尚不清楚。海马内部神经环路受到遗传和表观遗传的影响。cAMP是调节细胞遗传基因编码和表观遗传因子表达的核心信使,除激活PKA外,cAMP还能直接激活鸟嘌呤核苷酸交换蛋白(EPAC, Exchange Protein Activated by Cyclic AMP)。在以学习记忆障碍为主要临床表现的老年性痴呆患者脑内,EPAC基因表达异常。然而,EPAC信号传导通路是否通过调控遗传基因的转录和翻译,从而介导海马神经环路突触可塑性和学习记忆的形成尚不清楚。[目的]在整体水平探讨情绪学习或单纯情绪应激对海马突触形态和突触传递可塑性及海马依赖性空间情节记忆的影响及相关分子机制；探讨EPAC偶联的遗传与表观遗传信号通路对海马神经环路突触可塑性和学习记忆的调控机制。[方法]在情绪影响海马依赖性空间记忆及机制的研究中,我们采用电跳台和单纯电击范式复制情绪学习和情绪应激动物模型,Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力；采用免疫印迹检测突触相关蛋白表达水平；采用免疫组化检测杏仁核和海马神经元激活情况；采用脑片膜片钳电生理学技术检测海马突触传递可塑性；采用Golgi-cox染色和电镜检测海马突触形态可塑性；采用NMDA (N-methyl-D-aspartate)受体阻断剂(D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid)抑制杏仁核基底外侧核,明确基底外侧核在情绪学习或单纯情绪应激影响海马依赖性空间学习记忆中的作用；采用基因沉默技术明确GluR2在情绪影响海马依赖性空间学习记忆中的作用。在EPAC偶联的遗传与表观遗传信号通路对海马神经环路突触可塑性和学习记忆调控机制的研究中,我们选用EPAC1-/-、EPAC2-/-、EPAC1/2-/-和IN-EPAC小鼠,采用Morris水迷宫检测空间学习记忆能力；采用新鲜事物刺激,检测社交能力；采用Golgi-cox染色和电镜检测海马突触结构；采用免疫印迹检测突触相关蛋白表达水平和Zif268蛋白水平；采用全细胞膜片钳电生理学技术检测海马突触传递可塑性；采用miRNA芯片检测1miRNA变化；采用q-PCR检测miR-124和Zif268水平；采用荧光素酶报告系统研究miR-124和Zif268相互作用；构建了锁核苷酸修饰的反义寡核苷酸(LNA-miR-124)选择性抑制脑内miR-124的表达；构建腺相关病毒载体表达miR-124；我们采用Rap1抗体进行染色体免疫共沉淀检测Rap1与miR-124相互作用。[结果]1.情绪相关学习通过杏仁核基底外侧核易化海马依赖性空间记忆,G1uR2参与情绪相关学习增强海马突触形态及其传递功能。为探讨情绪对海马依赖性空间学习记忆的影响,我们采用电跳台学习和单纯电击复制情绪依赖性学习和情绪应激模型,结果显示二者均能显著激活杏仁核基底外侧核(BLA)。与单纯应激组比,学习组能选择性激活海马CA1和CA3区神经元,并增加海马CA1和CA3区突触相关蛋白GluR2的表达；Morris水迷宫检测结果显示,情绪相关学习能明显易化海马依赖性空间学习与记忆；脑片膜片钳检测发现,情绪相关学习能明显易化海马CA1区晚期LTP的形成。为进一步明确杏仁核BLA在情绪学习易化海马依赖性记忆功能中的作用,我们采用NMDA受体阻断剂AP5抑制BLA再进行电跳台学习训练,然后检测大鼠海马依赖性空间学习记忆能力。结果显示,阻断BLA时上述情绪相关学习对海马依赖性学习记忆的促进作用几乎消失；同样,用基因沉默技术降低海马CA1区GluR2水平时,情绪相关学习对空间记忆准确性的易化作用消失,而对学习过程无影响。2.EPAC失活突变通过增加miR-124转录,抑制Zif268翻译损伤空间学习记忆和社交能力。为探讨EPAC对海马神经环路突触可塑性及学习记忆的影响,我们制备了EPAC1, EPAC2单基因以及EPAC1/EPAC2双基因失活突变小鼠,并与野生型对照小鼠进行对比研究。行为学检测发现EPAC失活突变明显损伤海马依赖性空间学习记忆功能,同时电生理学检测结果表明EPAC失活突变减少突触前谷氨酸释放能力,损伤突触传递长时程增强效应。形态学检测结果表明EPAC失活突变不影响中枢神经元发育及突触结构,蛋白质免疫印迹结果表明EPAC失活突变不影响突触相关蛋白表达。为进一步探讨EAPC失活突变损伤突触可塑性和学习记忆的机制,我们采用miRNA芯片检测发现EPAC失活突变明显增加miR-124水平。染色体免疫共沉淀结果结合药物激活EPAC试验证实Rap1直接与miR-124基因的上游调控元件相互作用调控miR-124转录。采用LNA-miR-124选择性抑制脑内miR-124的表达能逆转EPAC失活突变的表型,过表达miR-124能模拟EPAC失活突变的各种表型。为寻找miR-124特异的靶mRNA,我们进行了全基因组比较分析,结果显示Zif268明显下调。为明确miR-124对Zif268 mRNA的直接作用,我们突变Zif268并运用荧光素酶报告系统,结果显示miR-124可以直接结合Zif268mRNA并发挥抑制效应,同时过表达Zif268能有效逆转miR-124增高的各种表型。此外,我们还发现EPAC失活突变损伤小鼠的社交能力。[结论]1.情绪相关学习通过杏仁核基底外侧核促进GluR2表达,易化海马突触形态及海马依赖性学习记忆功能。2.EPAC失活突变通过增加miR-124转录,抑制Zif268翻译损伤空间学习记忆和社交能力。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

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本文编号：2297447