皮肤毛囊神经嵴干细胞的黑素定向分化和衰老机制研究

发布时间：2018-10-29 20:35

【摘要】：研究背景白癜风是表皮黑素细胞(MC)毁损导致的获得性色素脱失性皮肤病。虽然该病并不影响个体生存,但可严重损害容貌外观,妨碍工作、学习、婚恋等社交活动,导致沉重的精神和经济负担,甚至发展成为心身性疾病,威胁家庭和睦及和谐社会的构建。但棘手的是,由于其病因复杂、确切机制尚不明了,目前沿用的治疗方法效果尚不完全令人满意。因此,进一步阐明白癜风的发病机理对于寻找新的治疗靶点有着至关重要的意义,其中从干细胞生物学的角度出发,探索皮肤干细胞→MC分化和增殖的调控机制将会是个有益的尝试。研究对象皮肤干细胞是真、表皮及附属器中处于未分化的原始阶段、能进行自我更新、同时也可分化成特定组织类型的“种子细胞”。其中,神经嵴干细胞(NCSC)是源自胚胎神经板的多能干细胞,其迁移并定居在毛囊隆突、毛乳头和真皮,形成了皮肤黑素细胞、感觉神经元和施万细胞、真皮间质细胞等成分。因其强大的迁移分化和再生修复能力,NCSC是维持皮肤微环境稳态的重要力量,更是色素形成、毛发生长、创伤愈合等生理/病理功能的细胞学基础。因此说,对于皮肤病特别是色素疾病的基础研究,NCSC是个提纲挈领的切入点；对指导临床实践和开发新疗法,这也极具运用前景。研究结果一、毛囊NCSC的分离培养和鉴定干细胞龛是成体干细胞在体内集中存储的部位,它是由特定的基质细胞和细胞外基质共同构成的特殊微环境,毛囊隆突是皮肤NCSC最主要的龛之一本课题以小鼠触须为研究模型,采用显微外科方法分离隆突,探索并优化NCSC的培养方法。这些隆突来源干细胞具有很强的自我更新／增殖能力,能在无血清培养基中呈悬浮的克隆性生长,形成三维球体结构Bulge sphere。免疫荧光染色和RT-PCR显示,它们表达多种NCSC标志物如p75、Sox10、Nestin等和胚胎干细胞转录因子如Sox2、Klf4、cMyc等,进一步说明其是由未分化的幼稚细胞构成。在相应药物诱导下,隆突细胞可以定向分化成脂肪细胞、平滑肌细胞、神经元、施万细胞、骨和软骨等多种细胞类型,可见其很高的多向分化潜能。结论：皮肤NCSC来源丰富不受限,位置表浅易取材,多向分化运用广,伦理道德争议小,是比骨髓、脐血等更理想的干细胞来源。我们建立了从毛囊显微分离、NCSC培养到干细胞表型鉴定、多向分化诱导的一整套技术方法,为皮肤病基础研究和临床自体移植提供一种全新的干细胞来源。二、毛囊NCSC的黑素定向分化白癜风恢复期常见以毛囊为中心的点状色素沉着,同时病理显示有无色素的未成熟MC从毛囊向表皮迁出；而少毛/无毛部位,复色困难；进一步地,而且移植正常毛囊至白斑部位可以治疗白癜风：这都提示毛囊在成体皮肤色素系统的修复中起着重要作用。我们以毛囊NCSC为种子细胞,经过2-3周的MC方向诱导,分化细胞呈现类似正常MC的多极树突或双极树突外观,并表达MC特异标志物MITF和TYR。更重要的是,分化细胞呈多巴反应阳性,能将无色的L-DOPA转化成棕色色素颗粒,这就从功能上证实其具有合成黑色素的初步能力。效率低下一直是困扰MC体外分化的难题。为此,我们反复比较了各种诱导剂的效果,最后选定了一个含有ET-3、SCF、Wnt3a和TPA等多种成分的“鸡尾酒”式的复合配方,使得分化效率大幅上调,可达将近40%。为研究NCSC→MC分化的调控机制,我们以Realtime PCR动态监测若干重要分子在分化过程中的时相变化,发现在干细胞“命运决定”过程中属于“早期”事件、处于信号通路上游的MITF和TRP-2在诱导后很快激活表达,且表达幅度也很高；而处于级联反应的下游的TYR和Pmel17则较晚表达。结论：皮肤NCSC是表皮和毛发MC的来源,NCSC→MC的分化调控是色素疾病发病和临床干预的潜在靶点。我们从干细胞技术出发,建立了从NCSC→MC的高效分化方法,并初步研究了调控分化进程的分子机制。该内容为探索色素性皮肤病的成因和寻找新靶点奠定实验基础,也为临床MC自体移植提供一种便捷的细胞来源。三、毛囊NCSC的衰老衰老是随着年龄增长而发生的组织结构和生理功能的慢性损伤,每个个体均无法避免、逆转、或者中止。尽管抗衰老研究由来已久,但从干细胞生物学的角度切入却是个崭新的研究领域。我们以不同年龄小鼠来源的毛囊NCSC为模型,研究衰老对干细胞干性即自我更新和多向分化能力,以及迁移等重要功能的影响。结果显示随着年龄增长,毛囊NCSC增殖能力下降,形成神经球的数目减少、体积缩小,倍增时间明显延长；分化潜能亦显著衰退,成脂、成黑素分化出现障碍。老年NCSC还表现出较差的迁移能力,其驱动迁移的关键基因SIug表达下调,而与细胞粘附/锚定相关的基因N-CAM、N-Cadherin表达上调。在细胞衰老机制上,我们发现老年NCSC有较多的SA-β-gal+衰老细胞、较少的BrdU+增殖细胞、较多的G0/G1期静止细胞和较低的端粒酶活性。结论：皮肤衰老的本质是皮肤干细胞及其干细胞龛的衰老。本课题着重研究了衰老对毛囊NCSC干性的影响,并对其机制做了初步探索,这为解释皮肤衰老的病理机制和探索抗衰老的靶点提供了实验基础,也为替代治疗如何选择供体年龄提供了临床建议。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

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