高分辨探针熔解曲线快速检测耐药结核分枝杆菌的研究

发布时间：2018-11-04 12:23

【摘要】：研究背景：结核病是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的疾病,它流行于世界各国家与地区,在经济欠发达地区情况尤甚。由于结核病病程长、患者依从性差,加上抗结核药物的不当使用,使MTB出现了耐药性问题并逐渐加剧,导致结核病近年来又重新成为受到广泛关注的公共卫生问题。传统的诊断方法如痰涂片、药敏试验的检出率低,周期长,因此快速检测与诊断耐药结核就成为了结核病防治的重要攻关方向。研究证实MTB耐药的主要原因是菌株的基因变异,耐利福平(Rifampicin, RFP)突变主要位于rpoB基因中的81bp片段,耐异烟肼(Isoniazid, INH)突变主要位于katG315、inhA启动子、ahpC启动子、inhA94等位点。高分辨熔解曲线分析(High-resolution melting,HRM)是近年出现的一种应用于单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)分析的技术,是一种操作简便、快速、低成本、结果准确,并实现了真正的闭管操作的检测方法。在本研究中,我们将HRM应用于MTB的耐药相关基因katG、inhA、ahpC、rpoB的检测。目的：通过HRM与基因测序分别检测MTB耐药基因katG、inhA、ahpC启动子区域和rpoB81bp核心区域的结果对比研究,探讨HRM快速检测耐药结核分枝杆菌的异烟肼与利福平耐药突变位点的可行性。方法： 1.使用改良罗氏中性培养基转种菌株,对所培养的菌株进行INH与RFP的药物敏感性测定。 2.将所有312株菌株进行katG、inhA、ahpC、rpoB基因目的片段的测序,运用blastn进行序列比对和分析。 3.通过建立HRM方法,检测140株RFP耐药株rpoB中的81bp片段、150株INH耐药株katG315位、inhA启动子区、inhA94位、ahpC启动子区与rpoB8lbp核心区域,并与基因测序结果相比较,验证HRM在耐药结核分枝杆菌快速检测中的可行性。结果： 1.RFP与INH基因测序的突变率分别为95.7%(134/140)、92%(138/150)。HRM检测RFP与INH的突变率分别为95.7%(134/140),88.1%(133/150)。基因测序与HRM检测结果差别无统计学意义(p0.05)。 2.140例RFP耐药株HRM检测与基因测序的阳性符合率为97.8%(131/134),150株INH耐药株中HRM检测与基因测序的阳性符合率为96.4%(133/138) 3.HRM方法检测RFP的特异度为98.0%(150/153),灵敏度为93.6%(134/140),INH检测的特异度为98.7%(151/153),灵敏度为88.1%(133/150)。结论： 1.与基因测序相比,HRM检测在应用于耐药MTB的快速检测时有同样的阳性检出能力,但更加简便、快速。 2.与基因测序相比,HRM拥有良好的阳性符合率,但只能用于检测已知的突变位点。 3.HRM在用于检测RFP与INH耐药MTB时有着良好的灵敏度和特异度。
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【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R378

【参考文献】