FoxO3a信号网络在幽门螺杆菌感染中的作用

发布时间：2018-11-08 15:21

【摘要】：研究背景：在全球所有与癌症相关的死亡当中,胃癌居于第二位，并且胃癌是消化科最常见的恶性肿瘤之一。大量研究证实幽门螺杆菌感染与胃癌的发生有密切的关系。世界卫生组织已将幽门螺杆菌列为胃癌的头号致癌因子。全球感染幽门螺杆菌的自然人群比率超过总人口数的一半。目前，我们知道幽门螺杆菌与多种胃、十二指肠等消化道疾病有密不可分的关系，但其确切的致病机制至今尚未明确。 Forkhead(Fox)蛋白家族于2000年正式发布并被统一命名，目前被分为17个亚家族,其中对O亚家族(FoxO)的研究最为广泛及深入，它主要通过调控下游的靶基因如Bim，p27、CyclinD1等的转录水平，从而在细胞凋亡、细胞周期阻滞、DNA修复及氧化应激中发挥重要作用。前期研究表明Hp可激活人正常胃黏膜上皮细胞株GES-1细胞中的PI3K-Akt信号通路，进而引起细胞增殖、凋亡的紊乱。FoxO3a是Akt下游的靶分子之一，但Hp对FoxO3a的影响尚未见报道。为此，本课题围绕FoxO3a转录因子在Hp相关性胃粘膜疾病中的变化展开，并探讨Hp刺激对胃粘膜细胞株中FoxO3a转录因子及其下游靶分子Bim，p27、CyclinD1影响。研究目的： 1、研究FoxO3a转录因子在非萎缩性胃炎→肠上皮化生→不典型增生→胃癌这一胃粘膜病变过程中的变化，进而探讨其临床意义。 2、研究不同浓度的Hp作用于GES-1细胞不同时间后，对细胞生长的存活率的影响；并从翻译后蛋白表达水平及mRNA水平检测FoxO3a、pFoxO3a、p27、CyclinD1及Bim的表达，探讨Hp感染对FoxO3a信号网络的影响。研究方法： 1、体内研究部分选取南昌大学第一附属医院2007年1月至2009年9月胃镜活检或外科手术病理标本共149例，其中非萎缩性胃炎（Chronic Non-Atrophic Gastritis, CNAG）36例，化生性萎缩性胃炎（Chronic Metaphastic Atrophy Gastritis, CMAG）36例，异型增生（Dysplasia, Dys）38例，胃癌(Gastric Cancer, GC)39例为研究对象。采用免疫组织化学PV-9000二步法检测FoxO3a及pFoxO3a的表达。 2、体外研究部分（1）显微镜下观察不同浓度的Hp作用于GES-1细胞后发生的形态学改变。（2）采用四唑蓝（MTT）比色试验检测Hp按100：1、50：1及25：1的浓度作用于GES-1细胞后对其存活率的影响。（3）采用western-blot蛋白印迹（WB）法检测Hp按300：1、150：1及50：1的浓度作用于GES-1细胞后FoxO3a、pFoxO3a、p27及CyclinD1蛋白表达水平的变化。（4）采用实时定量PCR法检测Hp按300：1、150：1及50：1的浓度作用于GES-1细胞后FoxO3a、bim及p27mRNA表达水平的变化。研究结果： 1、体内研究部分：（1）对Hp阳性的CNAG、CAG伴IM、DYS与GC组不同胃粘膜病变标本中的FoxO3a进行统计学分析，在这四组之间无统计学差异（P＝0.1830.05）。在Hp阴性的CNAG、CAG伴IM、DYS与GC组不同胃粘膜病变标本中FoxO3a进行统计学分析，以上四组间有统计学差异（P＝0.0180.05），表现为FoxO3a在胃黏膜病变发展进程中呈降低趋势，并且在同一病变阶段中Hp阴性组FoxO3a的表达高于Hp阳性组。通过比较发现FoxO3a蛋白的表达量在Hp感染阴性与阳性组间有统计学差异（P0.05），表现为在Hp感染阴性组中FoxO3a蛋白呈高表达，而在Hp感染阳性组中FoxO3a蛋白呈低表达。（2）对Hp阳性CNAG、CAG伴IM、DYS与GC组不同胃粘膜病变的标本中的pFoxO3a进行统计学分析，在这四组之间无统计学差异（P＝0.0880.05）。在Hp阴性的CNAG、CAG伴IM、DYS与GC组不同胃粘膜病变标本中，pFoxO3a在以上四组间有统计学差异（P＝0.0080.05），表现为pFoxO3a在早期胃黏膜病变中呈下降趋势，但到胃癌时呈有升高趋势。分析pFoxO3a的表达量与Hp感染的关系结果表明，在Hp感染阳性与阴性组中pFoxO3a的表达量无明显差异（P0.05）。 2、体外研究部分：（1）显微镜下观察到Hp活菌作用于GES-1细胞24h后细胞发生典型的凋亡改变。镜下可见细胞轮廓逐渐变模糊，呈拉丝状，有空泡形成，且更为分散，逐渐脱壁，培养液中可见细胞凋亡崩解后颗粒状的产物。作用时间越长、作用浓度越高凋亡改变更明显。（2）MTT检测Hp对GES-1细胞存活率的影响。我们发现Hp活菌按不同的浓度比例作用于GES-1后在对其存活率是有影响的，有明显的统计差异（P0.05）。在100:1，50:1及25:1这三个不同浓度的Hp活菌作用于GES-1不同时间点时对细胞存活率的影响并不全都有统计学意义，在0h时100：1的存活率明显高于50：1组及25：1组，（P＝0.0040.05），随着作用浓度的降低其存活率也有所降低，在12h时细胞的存活率稍有升高，且有统计学意义（P＝0.0350.05），随着作用时间的延长，存活率迅速下降，，当作用时间达48h时，100：1组的存活率明显低于50：1级及25：1组，且有统计学差异（P＝0.0000.05），其余时间点在各浓度间无明显差异，无统计学差异（P0.05）。（3）Western blot检测Hp活菌对FoxO3a、pFoxO3a、p27及CyclinD1蛋白表达的影响。我们观察到Hp在按100：1及150：1的浓度作用于GES-1细胞在不同时间点FoxO3a的表达量是有差异的（P0.05），具体表现为在0.5h时就开始呈现增高的趋势，作用一段时间后达到峰值，之后呈现下降的趋势，有明显统计学差异（P0.05），但是150：1组的峰值（3h）要早于100：1组（6h），并且不难发现在Hp作用24h后FoxO3a的表达明显低于0h组。300:1组则未见明显差异（P0.05）。pFoxO3a的表达水平在这三个浓度组中均未见明显差异（P0.05）。P27的表达在100：1组与150：1组中均呈现随作用时间延长，先升高后下降，变化趋势与FoxO3a基本一致。100：1与150：1两组中，不同时间点的Cyclin D1表达具有统计学差异（P0.05），表现为逐渐升高，但在24h时难以检测出，在300：1组的前6h表达基本一致，但12h表达量开始下降，24h亦难以检测出。（4）Real-time PCR检测FoxO3a在三个浓度的Hp作用时其mRNA表达量是有变化的，具有统计学差异（P0.05），在100：1及150：1的作用浓度中FoxO3amRNA表达量随着作用时间的延长有先增高后降低的趋势，且有统计学差异（P0.05），在300：1组则无统计学差异（P0.05）。p27mRNA在三种Hp浓度作用时其mRNA表达量的差异有统计学意义（P0.05），在不同浓度作用时仅在150：1组Hp作用于GES-1是有差异的（P0.05），呈现先增高后降低的趋势，在100：1组及300：1组中则无统计学差异（P0.05），也未见明显趋势。Bim mRNA的表达量在100：1组有统计学差异（P0.05），其余组均无明显差异。这一结果与Western blot检测的结果不尽一致，但是我们知道对于某个基因的调节也存在转录后的调节，也就是说转录水平和翻译水平不一定是完全一致的，因为存在mRNA的修饰、运输、降解及其他一些小分子量RNA，如miRNA的调节，故某一个分子的mRNA表达量与蛋白表达量并不一定呈正相关。结论： 1、FoxO3a转录因子参与了Hp所致胃粘膜相关疾病的发生发展过程，并且与Hp的早期致病作用有关。 2、不同浓度的Hp活菌作用于正常胃黏膜上皮细胞时产生的作用不同。低浓度的Hp可在早期发挥促凋亡的作用，晚期在各种因素的影响下产生促增殖作用，但高浓度的Hp则在早期就起着促凋亡的作用，其发挥的促凋亡作用与时间无明显关系。 3、FoxO3a与p27随着Hp作用时间延长在正常胃黏膜上皮细胞内的表达变化趋势基本一致，都有先增高后降低的趋势，但是发生改变的时间点有所不同，Cyclin D1随着作用时间延长其表达量呈下降趋势，Bim的表达无明显变化趋势，但在长时间Hp的作用下表达量有所下降。因此在Hp感染的过程中FoxO3a可根据细胞的受损程度通过调控其下游物靶基因产生相应的改变，从而在Hp的致病中起着重要作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R378

【参考文献】