TNF-α诱导B16细胞自体吞噬的机制研究

发布时间：2018-11-11 14:54

【摘要】：目的在前期研究中发现,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)可以诱导小鼠黑色素瘤B16细胞凋亡,但是其是否能够诱导B16细胞发生自体吞噬目前尚不明确。因此,在前期研究的基础上,通过相差显微镜观察细胞活性、透射电子显微镜(TEM)观察细胞内是否存在自体吞噬泡及其数量的变化,分析TNF-a是否能够诱导B16细胞发生自体吞噬；进一步检测自噬相关基因和蛋白的表达变化,分析参与TNF-α诱导的B16细胞自体吞噬的关键因子；并通过检测自噬信号通路上的标志性基因和蛋白的表达,分析TNF-α诱导B16细胞自噬的信号通路,以及各通路对自噬的调控作用。方法 1.体外培养小鼠黑色素瘤B16细胞,根据处理方法不同分为对照组、TNF-α处理组(20ng/mlTNF-α处理12h、24h)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)+TNF-α处理组(lOmmol/L3-MA预处理2h,20ng/mlTNF-α处理12h、24h)。 2.相差显微镜观察TNF-α处理前后B16细胞的生长状态和细胞活性。 3.TEM观察TNF-a处理前后B16细胞内自体吞噬泡的变化。 4.收取细胞,提取细胞总RNA,聚合酶链式反应(PCR)检测自噬相关基因Atg5、Atg7、Atg12及内质网应激关键基因Chop mRNA的表达变化。 5.收取细胞,RIPA裂解液裂解细胞,提取细胞总蛋白,蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测自噬标志性蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬性死亡标志性蛋白Beclinl、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路及磷酸肌醇3激酶(P13K)/蛋白激酶B(PKB,又称Akt)通路关键蛋白核糖体S6蛋白激酶(p70S6K)及Akt磷酸化水平的变化。结果 1.与对照组相比,TNF-α处理后的B16细胞出现明显的生长抑制现象,可见部分细胞死亡,TNF-α处理12h后细胞死亡量约10%,24h后死亡量达30%,具有明显的时效关系。 2.与对照组相比,TNF-α处理后的B16细胞内,可见许多不同阶段的自体吞噬泡。 3.与对照组相比,TNF-α处理12h的B16细胞中,自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ和自噬性死亡标志性蛋白Beclinl的表达显著升高,24h较12h降低但仍高于对照组。3-MA+TNF-α处理组,12h时LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表达水平较TNF-α处理组12h下降,24h较TNF-α处理组24h升高。 4.自噬相关基因Atg5、Atg7、Atg12mRNA在TNF-α处理12h、24h后表达水平均显著升高；内质网应激关键基因Chop mRNA表达显著上调,呈时问依赖性。 5.与对照组相比,TNF-α处理组中p70S6K磷酸化水平显著下降,呈时间依赖性；Akt磷酸化水平显著降低,24h较12h升高。3-MA+TNF-α处理组中,p70S6K磷酸化水平在12h较TNF-α处理组升高,24h较TNF-α处理组降低；Akt磷酸化水平较TNF-α处理24h稍低。结论 1.TNF-α除了可以诱导B16细胞凋亡,还可以诱导B16细胞发生自体吞噬。 2.TNF-α诱导B16细胞的自噬作用达到一定水平后,自噬体的数量不再增加,自噬体的降解逐渐增多,从而导致自噬体数量下降。 3.TNF-α可以诱导B16细胞自噬性死亡。 4.TNF-α通过mTOR通路和PI3K/Akt通路诱导B16细胞自噬。 5.TNF-α可以导致B16细胞发生内质网应激。有研究发现,内质网应激可以导致细胞自噬。TNF-α是否可以通过内质网应激导致B16细胞自噬有待进一步研究。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】