HECT类泛素连接酶Smurf1的Neddylation修饰研究

发布时间：2018-11-12 08:34

【摘要】：HECT类泛素连接酶（E3）在骨稳态、肿瘤发生、病毒感染等过程中发挥重要功能，但其活性调控机制还很不清楚。Nedd8介导的类泛素修饰称为Neddylation。已知Neddylation修饰是Cullin-Ring类E3激活的必需条件，但其与HECT类E3的关系尚未见报道。本工作发现HECT类泛素连接酶Smurf1和类泛素蛋白Nedd8互作。Smurf1的蛋白稳定性和E3活性受到类泛素蛋白Nedd8的调控，且调控依赖Nedd8的Neddylation修饰能力。Smurf1能够被Nedd8进行Neddylation修饰，尤其在体外修饰体系中，Smurf1可以自我催化发生Neddylation修饰。另外，Smurf1可以与Neddylation修饰反应的E2Ubc12直接相互作用，Smurf1的HECT N-lobe小亚基介导与Ubc12相互作用，Ubc12的N末端1-26氨基酸残基，及中部核心结构域的活性中心H88-D89是结合Smurf1所必须的。Smurf1自我催化Neddylation修饰的酶活中心是C426，这个位点突变后Smurf1在体内将不能发生Neddylation修饰。HECT催化结构域中的C426突变后直接影响Smurf1对底物，如Smad5、RhoA等的泛素化降解。研究中还发现Smurf2具有与Smurf1类似的效应与机制。本工作在国际上首次建立HECT类E3与类泛素修饰之间的功能关联，且发现了一类新的HECT类E3活性调控机制。 为了鉴定Smurf1更多的底物以拓展它的生物学功能，我们以Smurf1的WW结构域为诱饵，利用酵母双杂交技术筛选到KLF2为其结合蛋白。KLF2属于Krüppel样家族蛋白成员，主要参与肺的正常发育，T细胞分化、迁移。本工作发现肺癌细胞中的KLF2为Smurf1在细胞核内的靶向降解底物。一系列泛素化修饰实验表明在肺癌细胞H1299中Smurf1为KLF2主要的泛素化降解E3。Smurf1靶向降解KLF2后将影响其转录因子活性及其对下游靶基因CD62L和Wee1的调控。 除了以Smurf1为线索的主体工作外，，我们揭示ATM可以磷酸化修饰微管结合蛋白NuSAP，修饰位点是NuSAP S124位点。ATM磷酸化修饰和结合NuSAP均发生于M期。此外，我们还发现RBBP6可结合转录抑制因子ZBTB38，并靶向ZBTB38泛素化降解。RBBP6敲低引起的G2/M阻滞和DNA双链断裂损伤可被ZBTB38敲低所阻断。由于RBBP6基因敲除小鼠胚胎致死，我们的研究将为寻找致死原因提供可分析的线索。
[Abstract]:HECT ubiquitin ligase (E3) plays an important role in bone homeostasis, tumorigenesis and viral infection, but the mechanism of its activity regulation is still unclear. The Nedd8 mediated ubiquitin modification is called Neddylation.. It is known that Neddylation modification is a necessary condition for the activation of Cullin-Ring class E3, but its relationship with HECT class E3 has not been reported. In this work, we found that the interaction of HECT ubiquitin ligase Smurf1 and ubiquitin like protein Nedd8. The protein stability and E3 activity of Smurf1 were regulated by ubiquitin like protein Nedd8, and the Neddylation modification ability of Nedd8 was regulated by Smurf1. Smurf1 could be modified by Nedd8 Neddylation. Especially in vitro, Smurf1 can catalyze Neddylation modification. In addition, Smurf1 can interact directly with Neddylation modified E2Ubc12, Smurf1 HECT N-lobe small subunit mediated interaction with Ubc12, Ubc12 N-terminal 1-26 amino acid residues. The active center H88-D89 of the middle core domain is necessary for the binding of Smurf1. The enzyme activity center modified by Smurf1 self-catalyzed Neddylation is C426. After this site mutation, Smurf1 will not be modified by Neddylation in vivo. The mutation of C426 in the catalytic domain of HECT has a direct effect on the degradation of Smurf1 to substrate, such as Smad5,RhoA, etc. It is also found that Smurf2 has similar effects and mechanisms as Smurf1. In this work, the functional association between HECT class E3 and ubiquitin modification was established for the first time in the world, and a new kind of HECT class E3 activity regulation mechanism was found. In order to identify more substrates of Smurf1 in order to expand its biological function, we used the WW domain of Smurf1 as bait and screened KLF2 as its binding protein by yeast two-hybrid technique. KLF2 belongs to Kr 眉 ppel like family protein member and is mainly involved in the normal development of lung. T cell differentiation and migration. In this work, we found that KLF2 in lung cancer cells is the target degradation substrate of Smurf1 in the nucleus. A series of Ubiquitin modification experiments showed that Smurf1 was the main Ubiquitin degradation of E3.Smurf1 in lung cancer cell H1299 and its transcription factor activity and its regulation on the downstream target genes CD62L and Wee1 were affected after the targeting degradation of KLF2 by Ubiquitin. In addition to the main work based on Smurf1, we found that ATM can phosphorylate the NuSAP, modification site of microtubule binding protein NuSAP S124. Both ATM phosphorylation modification and binding NuSAP occur in M phase. In addition, we also found that RBBP6 can bind to transcription inhibitor ZBTB38, and target ZBTB38 ubiquitin degradation. G 2 / M block and DNA double strand break damage induced by RBBP6 knockout can be blocked by ZBTB38 knockout. As RBBP6 knockout mouse embryos die, our research will provide analytical clues for finding the cause of death.
【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R341;Q55

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本文编号：2326613