氧化应激中热休克蛋白90与细胞周期蛋白Cyclin B1关系的探讨

发布时间：2018-11-15 09:53

【摘要】：研究背景 氧化应激(Oxidative Stress)是指机体在内外环境有害刺激的条件下,体内产生活性氧自由基(Reactive Oxygen Species, ROS)和活性氮自由基(Reactive Nitrogen Species, RNS)所引起生理和病理反应。由于它们可直接或间接氧化或损伤蛋白质、脂质和DNA,从而诱发蛋白质变性、脂质过氧化和基因突变,氧化应激是一把“双刃剑”：一方面氧化应激是机体一种最基本的保护机制,通过调节体内多种信号通路,调控多种转录因子,参与体内炎症、免疫、细胞增殖、细胞再生、修复等过程；另一方面超出体内抗氧化系统清除能力的氧化应激,可导致ROS的大量积蓄,引起细胞和组织的损伤,并参与心血管疾病、器官纤维化、创伤愈合延迟、糖尿病、神经退行性变及衰老和肿瘤的发生进程。 已知蛋白质质控系统与氧化应激下细胞周期调控密切相关,而作为蛋白质质控系统的重要伴侣分子Hsp90对维持氧化应激下细胞的正常功能和存活至关重要。氧化应激所致细胞周期阻滞状态下,Hsp90是否参与细胞周期蛋白cyclin B1变化的调节,两者之间是如何相互作用的?上述机理的阐述将为氧化应激相关疾病的机制研究、疾病治疗、疾病预防和新药开发提供帮助。 目的 1.确定氧化应激处理对HepG2细胞周期存在影响； 2.研究氧化应激条件下,HepG2细胞内Hsp90a和Cyclin B1的表达情况,两者的共定位情况以及两者的相互作用情况； 3.通过慢病毒介导的GFP-Hsp90αE47A基因在HepG2细胞内表达,从而竞争性抑制细胞内总Hsp90α的ATPase活性； 4.在上一步的基础上分析Hsp90对Cyclin B1的调节作用及对细胞周期阻滞的影响,并以此进一步探讨在氧化应激条件下细胞周期阻滞的分子机制及Hsp90α参与调节的作用机制。 方法 1.氧化应激HepG2细胞分组：将细胞分为对照组、氧化应激2h组、4h组、6h组、8h组、12h组、24h组。氧化应激因素：500μmol/L H2O2,分别刺激相应的时间； 2.流式细胞术检测细胞周期变化； 3.免疫印迹法检测细胞内羰基化蛋白、Hsp900α、Cyclin B1、泛素化蛋白、泛素化Cyclin B1蛋白的变化； 4.荧光显微镜下观察转染Hsp90αE47A/psin-GFP基因的在HepG2细胞表达情况； 5.荧光定量PCR检测氧化应激后HepG2及Hsp90αE47A突变株Cyclin B1 mRNA变化情况； 6.免疫荧光检测Hsp90α和Cyclin B1细胞内共定位情况,免疫共沉淀法检测Hsp90与Cyclin B1相互作用情况。 结果 1.H2O2诱导的氧化应激后细胞内羰基化蛋白表达量明显增多； 2.细胞氧化应激24小时后,出现明显的G2/M期阻滞； 3.氧化应激导致胞内Hsp90α蛋白表达量增加,6h,8h组出现高峰,12h-24h水平下降渐至正常；随氧化应激时间延长,Cyclin B1蛋白表达总量增加,磷酸化CyclinB1蛋白表达量先增加再降低； 4.转染Hsp90aE47A/psin-GFP基因的细胞在倒置荧光显微镜下可观察到明显的绿色荧光；免疫印迹结果显示,转染Hsp90αE47A基因的细胞,与未转染的对照组细胞比较,有明显外源性GFP-Hsp90aE47A蛋白的表达； 5.氧化应激后HepG2及Hsp90a E47A突变株Cyclin B1 mRNA表达量未增加；Hsp90αE47A突变株细胞在无氧化应激处理和6h氧化应激条件下Cyclin B1蛋白水平较HepG2细胞对照组增加；流式检测HepG2及Hsp90αE47A突变株细胞周期结果：氧化应激24小时后HepG2及Hsp90αE47A突变株H202处理6小时组和未处理组均出现G2/M期阻滞； 6.免疫荧光与免疫共沉淀结果提示,随着刺激时间的延长,Hsp90与CyclinB1相互作用增强,24h时处理组比对照组明显增多； 7.免疫共沉淀结合免疫印记法检测细胞泛素化Cyclin B1蛋白水平变化结果：随着氧化应激时间增加,泛素化Cyclin B1水平增加。 结论 1.H202作用于HepG2细胞不同时间,对细胞产生的氧化应激损伤增强,在24h出现明显的G2/M期阻滞。 2.氧化应激可影响细胞内Hsp90a和Cyclin B1的表达并改变其细胞内分布与两者的相互作用。 3.不同的氧化应激水平和Hsp90α分子伴侣功能的变化共同影响对Cyclin B1的泛素化蛋白酶体降解通路,并对Cyclin B1的蓄积起着决定性作用,从而导致G2/M期阻滞。 4.通过慢病毒转染使GFP-Hsp90aE47A基因在HepG2细胞中稳定表达,为后续实验建立了基础。
[Abstract]:Study Background The oxidative stress refers to the physiological and pathological changes of reactive oxygen radical (ROS) and reactive nitrogen radical (RNS) in the body under the condition that the body is harmful to the internal and external environment. Because of their direct or indirect oxidation or damage to proteins, lipid and DNA, to induce protein denaturation, lipid peroxidation and gene mutation, oxidative stress is a 鈥渄ouble-edged sword鈥，

本文编号：2332960