弓形虫致密颗粒抗原GRA7疫苗初免—加强免疫策略增强小鼠抗弓形虫感染的免疫保护性研究

发布时间：2018-11-18 13:38

【摘要】：弓形虫是一种细胞内寄生的原虫,可感染包括人在内所有温血脊椎动物的有核细胞,引起人兽共患弓形虫病,严重威胁着人类健康和畜牧业生产。目前为止,尚无有效的治疗药物。鉴于疫苗防治多种疾病的经验,研制安全有效的抗弓形虫疫苗不失为一种具有潜力的防治措施。为此,本研究制备了弓形虫致密颗粒抗原GRA7的DNA疫苗和蛋白疫苗,将其接种于BALB/c小鼠,评价疫苗的免疫效果,并观察异质性prime-boost免疫策略对小鼠免疫应答的影响,为研制安全有效的弓形虫疫苗及优化免疫方案奠定基础。 目的：构建编码弓形虫致密颗粒抗原GRA7的真核表达质粒pEGFP-GRA7和原核表达质粒pET30-GRA7,分别制备弓形虫GRA7的DNA疫苗和蛋白质疫苗,评价疫苗的免疫效果,观察prime-boost免疫策略对小鼠免疫应答的影响。 方法：采用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增弓形虫致密颗粒抗原GRA7基因,回收PCR产物,将其连接至克隆载体pEASY-T1中,构建克隆载体pEASY-GRA7,分别进行菌落PCR、酶切和测序鉴定。采用亚克隆技术将GRA7基因分别克隆至真核表达载体pEGFP-C1和原核表达载体pET-30a(+)中,分别构建能表达GRA7的重组真核表达载体pEGFP-GRA7和重组原核表达载体pET30-GRA7,并对它们进行鉴定。将pEGFP-GRA7转染HFF细胞,经荧光显微镜观察、SDS-PAGE和Western blotting分析、鉴定后,大量提取重组质粒pEGFP-GRA7用于制备弓形虫GRA7DNA疫苗。将pET30-GRA7转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,采用镍柱亲和层析法纯化GRA7蛋白,SDS-PAGE和VWestern blotting分析鉴定后,制备弓形虫GRA7重组蛋白疫苗。动物实验观察疫苗的免疫效果,同时评价异质性prime-boost免疫策略对BALB/c小鼠免疫应答的影响。结果：经PCR体外扩增获得GRA7基因片段,大小为708bp。重组真核表达质粒pEGFP-GRA7经菌落PCR、双酶切鉴定,琼脂糖凝胶电泳结果显示在708bp处有一特异性条带,与预期GRA7目的基因片段大小一致；DNA测序结果显示目的基因片段GRA7准确插入真核表达质粒中。pEGFP-GRA7转染的HFF细胞经荧光显微镜观察、SDS-PAGE和Western blotting分析,均能检测到GRA7蛋白的表达。重组原核表达质粒pET30-GRA7经菌落PCR、双酶切鉴定,琼脂糖凝胶电泳结果显示在708bp处有一特异性条带,与预期GRA7目的基因片段大小一致；DNA测序结果显示目的基因片段GRA7准确插入原核表达质粒中。pET30-GRA7转入E.coli BL21诱导产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,可检测到GRA7蛋白的表达。采用异质性prime-boost免疫策略接种BALB/c小鼠,其中DNA疫苗初免-蛋白加强免疫组小鼠抗弓形虫IgG、IgG2a和IFN-γ水平均高于其它实验组(P0.05),而各组间IL-4和IL-10水平差异无显著性。 结论：体外扩增弓形虫致密颗粒抗原GRA7基因并亚克隆到表达载体中,成功制备了弓形虫GRA7的DNA疫苗和蛋白疫苗。采用DNA疫苗初免-蛋白加强免疫策略可诱导小鼠较强的抗GRA7的体液免疫和细胞免疫,显著增强小鼠抗弓形虫感染的保护作用。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392

【参考文献】

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本文编号：2340173