【摘要】：抗原表位(epitope),又称抗原决定簇(antigenic determinant,AD)指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团,抗原以此与相应淋巴细胞表面的受体结合,进而引发免疫应答和免疫反应。 抗原-抗体的相互作用是免疫反应的核心。一系列研究工作表明,表位的精确定位,在生物医学应用,如合理设计疫苗、设计及筛选新型药物、研发新的诊断试剂和免疫治疗策略的发展中至关重要。 随着现代实验技术的发展,目前通常利用重叠肽段覆盖整个抗原序列来判定抗原表位。然而,抗体表位作图一直受限于高昂的成本和进行三维结构解析所耗费的大量时间投入。 近年来,随着抗原-抗体复合物的解析技术不断完善,在蛋白质结构数据库(PDB)中包含的抗原-抗体复合物结构数据不断增加。伴随生物信息学技术的不断发展,由于抗体序列、结构的高度保守,可以通过计算机辅助分子模拟技术合理确定抗原表位特征,揭示免疫分子识别新的特征。 在我们的研究中,将TNF-α、C5a作为研究对象,选择自主研发的具有中和活性的抗TNF-α人源抗体TGMB、抗C5a鼠源抗体P29、F20,基于抗原(TNF-α、C5a)晶体结构以及理论模拟获得的抗体片段Fv的三维构象,借助计算机辅助分子对接技术、动力学模拟技术构建抗原-抗体相互作用的复合物模型,利用分子生物学突变实验以及功能评价方法对理论预测的抗原表位进行实验验证。具体工作如下: 1、利用计算机同源模建、分子对接以及动力学模拟从理论上构建TNF-α与抗体TGMB相互作用空间结构,合理预测TGMB特异性识别TNF-α的关键位置,通过定点突变技术对理论预测结果进行验证。 作为一种多功能的细胞因子,TNF-α参与许多重要的生理功能。然而,TNF-α的过表达会破坏机体的免疫平衡,与类风湿性关节炎、Crohn’s病等多种疾病密切相关。拥有自主知识产权的TGMB是一株具有良好中和活性的人源抗TNF抗体,其识别TNF表位及作用模式尚不清楚。本研究中,基于获得的TGMB可变区序列,通过计算机辅助分子模拟技术搭建抗体TGMB可变区Fv三维结构,并通过力学优化确定其稳定的空间构象。利用已解析的TNFα晶体结构,通过分子对接获得TGMB-Fv片段与TNFα相互作用的复合物模型,经计算机图形学技术、计算生物学相关理论,预测抗原抗体相互识别区域、关键氨基酸残基及作用模式;根据突变体序列设计引物,利用重叠PCR技术扩增目的基因,构建相应的突变体原核表达载体进行蛋白表达,通过ELISA、蛋白相互作用和功能检测实验等手段对突变体进行评价,验证功能位点。结果证明与理论预测一致。 2、针对自主研发的中和性抗C5a鼠源抗体F20、P29,利用计算机辅助同源模建技术搭建抗体可变区的空间构象;借助C5a的晶体结构,通过分子对接、动力学模拟从理论上预测抗体F20、P29特异性识别C5a的表位结构;在合理预测其表位结构的基础上,应用生物学实验技术对理论模型进行验证,确定其相互作用的合理模式。 C5a是动物血清中的补体系统在激活过程中的一个裂解片段,是炎症反应的重要介质和趋化因子,具有广泛的生物学功能。在急性肺损伤、脓毒血症、脑膜炎、风湿性关节炎、肾小球肾炎等病理过程中起重要作用。如在败血症的发病过程中存在补体系统的过渡活化,机体内出现了大量C5a,在大鼠和小鼠的败血症模型中,已经证明体内用C5a抗体阻断C5a可以明显提高动物的生存率。 本研究中,通过计算机辅助分子模拟对鼠源抗体F20、P29可变区三维结构进行合理搭建,并通过力学优化获得其稳定的三维构象。利用已解析的C5a晶体结构,通过分子对接分别获得F20片段、P29片段与C5a相互作用的复合物模型,经计算机图形学技术、计算生物学相关理论,预测抗原抗体相互识别区域,关键氨基酸残基、理论上确定抗原的功能表位。然后利用利用重叠PCR技术扩增目的基因,构建相应的突变体原核表达载体并进行表达纯化,通过ELISA、分子相互结合的动力学分析等手段评价突变体的结合能力。同时,在细胞水平,对突变体的功能活性进行评价,确定功能位点。 本研究成功地运用计算机辅助分子模拟技术,探讨抗原与功能抗体的作用复合物结构来合理判定抗原功能表位。主要结果有:1、利用分子模拟技术构建了TNF/TGMB的复合物结构,合理预测了TNF的关键功能表位D143,并通过分子生物学突变技术、ELISA、蛋白相互作用和细胞水平的功能实验进行了验证,证明了预测结果的合理性。2、首先借助蛋白质的空间构象特征,利用计算机辅助分子模拟对蛋白质的理化性质进行研究,合理预测了蛋白质潜在的功能表位。进一步借助北京天广实生物技术股份有限公司获得的具有自主知识产权的鼠源抗体F20、P29,通过计算机辅助分子模拟技术,利用分子对接、计算机图形学方法合理预测C5a的功能性抗原表位。进而通过分子生物学突变技术构建C5a突变体,借助ELISA、蛋白相互作用等验证F20、P29识别C5a核心结合位点,利用建立的C5a功能检测平台对突变体进行活性评价,确定D31、R37、K68核心结合位点的生物学功能,验证理论预测的结果,同时证明了方法的合理性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392
【共引文献】
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