宿主抗衣原体感染中NKT细胞和NK细胞相互作用的研究

发布时间：2018-11-25 20:37

【摘要】：衣原体(Chlamydia)是一类革兰氏染色阴性的专性细胞内寄生菌,其中包括人们所熟知的人类致病菌沙眼衣原体(C. trachomatis、Ct)和肺炎衣原体(C. pneumoniae、Cpn)。衣原体通过感染结膜、呼吸道以及生殖道粘膜上皮细胞导致广泛的人类疾病。沙眼衣原体是最常见的导致性传播疾病的病原菌,并能引起多种长期后遗症,如慢性盆腔炎,不孕症,异位妊娠。而沙眼衣原体中的沙眼血清型还是引起可预防性感染性失明的主要原因。肺炎衣原体是一系列人类急慢性呼吸道疾病的病因,如上呼吸道感染,肺炎以及慢性阻塞性肺疾病(COPD)。最新的研究还显示了肺炎衣原体与动脉粥样硬化性心血管疾病以及部分脑神经失调的发展和高风险密切相关。流行病学研究表明衣原体感染仍然是严重的世界范围内的公共健康问题。虽然抗生素治疗对衣原体感染有效,但是由于衣原体感染通常以无症状的隐形感染形式存在,使得被感染者不能及时的寻求诊断和治疗,从而在一定程度上限制了抗生素治疗对衣原体感染的控制力。因此,开发安全有效的疫苗对于干预高流行性衣原体感染和预防长期后遗症具有更加重要的意义。迄今为止,由于缺乏对衣原体感染免疫机制的深入了解,尚无预防衣原体感染的有效疫苗。对宿主抗感染机制的最新研究进展揭示了固有免疫和适应性免疫的连接在控制和清除感染性疾病中的重要作用。NK细胞和NKT细胞是固有免疫系统的重要组成部分,其作用涉及多种类型的疾病,并在连接固有免疫和适应性免疫中发挥桥梁作用。虽然它们分属于不同的细胞谱系,但NK细胞和NKT细胞表现出惊人的相似性,例如表达相同的NKR-P1和Ly49受体,具有无需前期致敏即发挥效应功能的能力。它们在最初的抗感染斗争中发挥关键作用,并且通过与树突状细胞的相互作用对适应性免疫的建立和发展作出重要贡献。一些前期研究揭示了NK和NKT细胞应答涉及多种类型的衣原体感染。NKT细胞在控制两种不同的衣原体鼠型衣原体C. muridarum (Cm)和肺炎衣原体C. pneumoniae (Cpn)感染中发挥不同作用。NK细胞在Cm小鼠生殖道感染中起保护性作用,但是对RAG-/-小鼠Cpn肺感染模型的研究显示NK细胞在固有的抗感染机制中似乎不起作用。虽然这些研究显示了NK细胞涉及宿主抗衣原体感染的现象,但是NK细胞发挥其功能的具体机制仍然不清楚。此外,在衣原体感染中,NK与NKT这两种重要的固有免疫细胞之间的相互关系尚无报道。在本研究中,利用抗体封闭策略以及基因缺陷小鼠,我们着重探讨了两方面的问题：1)采用两种不同的衣原体感染模型,研究衣原体感染中NKT细胞对NK细胞功能的调节作用。2)NKT细胞对NK细胞功能的调节作用的机制。 (一)NKT细胞对NK细胞两种主要功能(IFN-γ的产生和杀伤功能)的调节作用,以及这种作用与NK细胞亚型自然杀伤T细胞(NKT细胞)是一类独特的T淋巴细胞亚群。NKT细胞作为一种调节细胞能够影响多种免疫细胞(如树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞和NK细胞)功能的调节,同时作为一种效应细胞能够杀伤肿瘤细胞。一些研究利用α-GalCer对NKT细胞的特异性激活作用揭示了NKT细胞对NK细胞的调节作用。但是这种调节是否在疾病状态以及天然微生物感染中同样发挥作用目前尚不清楚。本研究在Cm呼吸道感染模型中,利用NKT细胞缺陷小鼠和抗体封闭(anti-CD1dmAb)策略,阐明了在衣原体感染中NKT细胞是否能够影响NK细胞的免疫应答,揭示了NKT细胞对NK细胞产生IFNγ以及对靶细胞杀伤的不同调节效应。 1.体外实验中,鼠全脾细胞感染Cm后NK和NKT细胞的应答情况将未感染C57BL/6鼠全脾细胞在体外与活的Cm原体(EB)共培养,在感染后的不同时间点,我们通过采用流式细胞术检测了细胞表面早期活化标志CD69的表达,从而评估NKT细胞(NK1.1+CD3e+)以及NK细胞(NK1.1+CD3e-)的活化情况。同时我们利用细胞内细胞因子染色技术检测了这两种细胞IFNy的产生水平。结果显示：Cm体外感染迅速增加了CD69在NK及NKT细胞上的表达,诱导了NK和NKT细胞IFNy的迅速产生。上述体外实验结果说明衣原体感染可以诱导NKT细胞和NK细胞的活化以及IFNy产生。 2.体外培养系统中,Cm活化的NKT细胞对NK细胞的影响。为了分析在衣原体感染中NKT细胞是否能够影响NK细胞,我们在体外感染系统中比较了野生型小鼠和NKT基因敲除小鼠(Jα18-/-)脾脏NK细胞的应答情况。通过在不同时间点检测CD69和IFNy的表达情况,我们发现：相对与野生型小鼠,NKT KO小鼠的NK细胞表现出显著降低的CD69表达。由于NKT细胞的活化主要依赖于CD1d-TCR的相互作用,因此我们在培养野生型小鼠脾细胞的加入CD1d封闭抗体,从而进一步确认NKT细胞活化对NK细胞的影响。用抗体封闭CD1d与TCR的相互作用从而阻断NKT细胞的活化,显著抑制了NK细胞CD69的表达和IFNy的产生。利用NKT KO鼠以及CD1d抗体封闭实验,我们证实了NKT细胞对NK细胞活化和细胞因子产生的重要调节作用。然而NK细胞CD69表达和IFNy产生并非完全依赖于NKT细胞。 3.体内Cm感染模型中,NKT和NK细胞的活化及扩增在体外感染系统中,我们已经揭示了Cm感染后NKT和NK细胞的活化以及NKT细胞对NK细胞的影响。继而,我们进一步在衣原体体内感染模型中观察了NKT和NK细胞对衣原体呼吸道感染的应答情况。Cm肺感染后,两种细胞在淋巴细胞中百分比均显著增加,同时两种细胞的绝对数也明显增加。除此以外,我们还观察到肺NKT细胞和NK细胞增加了CD69的表达。脾脏中有类似的现象。结果说明Cm呼吸道感染可以诱导NKT和NK细胞的活化及数目的扩增,从而进一步验证了体外实验中所得到的结果。 4.Cm呼吸道感染后NK细胞的功能改变在观察到Cm肺感染中NK细胞的活化及数目的扩增后,我们进一步检测了NK细胞活化后功能的变化,包括IFNy的产生以及对靶细胞的杀伤效应。结果显示：肺NK细胞在感染后第一天就表现出迅速加强的IFNy分泌。流式细胞术检测NK细胞表面CD107a的表达情况,显示Cm的感染显著加强了NK细胞的脱颗粒作用,即增强了杀伤功能。以上结果提示我们在Cm肺感染过程中,NK细胞不仅快速产生了IFNy,而且显示出增强的杀伤功能。 5.NKT细胞缺陷对NK细胞功能的调节为了进一步研究衣原体感染后NKT细胞对NK细胞的调节作用,我们首先比较了野生型小鼠和NKTKO鼠在衣原体感染后脾脏和肺部NK细胞数目的改变：NKTKO鼠在Cm感染后,脾和肺NK(CD3-NK1.1+)的百分比和绝对数均显著低于野生型小鼠。其次,我们比较了感染后两种小鼠NK细胞IFNy的产生和脱颗粒作用从而进一步检测NKT细胞对NK细胞功能的影响。感染后3天,NKT缺陷小鼠的肺和脾脏中产IFNy的NK细胞的百分比明显低于野生型小鼠。相反,NKT缺陷小鼠的肺和脾脏NK细胞在YAC-1的刺激下脱颗粒的水平(即CD107a的表达)反而明显高于野生型小鼠。以上结果提示,NKT细胞对NK细胞的扩增有正向的积极的影响,但是,NKT细胞对NK细胞功能的影响则显示出相反的作用,即,在Cm感染过程中NKT细胞促进了NK细胞IFNy的产生但却抑制了NK细胞的杀伤功能。 6.NKT细胞对NK细胞功能的调节作用与NK亚型的关系。在前面的实验中,我们已发现NKT细胞对NK细胞产生IFNy和杀伤功能的调节是不同的。如前所述,NK的不同亚群在其功能上各有偏重。而NKT细胞对NK两种功能(IFNy和杀伤)的调节差异,可能和NKT细胞针对NK细胞各个亚群调节作用的差异有关。基于NK1.1+CD3e-NK细胞上CDllb和CD27的表达,我们分别检测了Cm感染后野生型小鼠和NKTKO鼠NK细胞亚群的比例：相对野生型小鼠,感染后NKT KO鼠中NK细胞各个亚群的百分比发生明显变化。结果说明,NKT细胞对NK细胞的成熟有一定影响,表现在NK亚型比例的改变,但是这种影响在感染的组织(肺)中是很微小的。进一步我们探讨了NK细胞亚型的功能,包括检测脾脏和肺中不同NK亚型的IFNy产生和杀伤功能。结果发现,Cm感染过程中脾脏和肺的各个NK细胞亚群在产生IFNγ以及杀伤过程中表达CD107a的能力有所不同,CD27highCD11bhighNK细胞在所有的NK细胞亚群中产生IFNy的能力最高,并在杀伤过程中表达最高水平的CD107a。比较野生型小鼠和NKTKO小鼠中NK细胞亚群的功能差异,我们发现,NKT细胞对NK细胞不同功能的不同调节作用在不成熟的CD27highCD11blow和终末成熟的CD27lowCD11bhighNK细胞亚群有所体现,但在较成熟CD27highCD11bhigh NK细胞亚群中表现的更加显著。 (二)树突状细胞(dendritic cell, DC)参与了NKT细胞对NK细胞功能的调节前期的研究报道了NKT细胞在Cm和Cpn感染中的不同作用并导致了不同的疾病结果。因此,我们进一步研究了NKT细胞对NK细胞功能的调节作用在Cpn感染中是否有所差异。 1. C. pneumoniae感染诱导NK细胞的迅速扩增首先,我们检测了C. pneumoniae肺感染后NK细胞应答的动力学模式。收集感染前和感染后不同时间点的肺单个核细胞以及脾细胞,通过免疫荧光染色和流式细胞术分析NK细胞的数量变化,结果显示NK1.1+CD3e-细胞的百分比和绝对数在感染后第一天开始上升,在感染后第3天达到峰值。随后NK细胞逐渐减少大约在第9天回到基础水平。 2. C. pneumoniae感染后NK细胞迅速活化并产生IFNγ 为了确定感染后NK细胞是否改变了活化状态,我们检测了肺脏和脾脏NK细胞表面两种早期活化标志CD69和CD25的表达变化。我们发现：C. pneumoniae感染后24小时NK细胞即快速上调了CD69的表达。同时,细胞内细胞因子染色显示,NK细胞活化后产生大量IFNγ。结果表明,肺炎衣原体呼吸道感染进程中,无论是在免疫器官还是感染部位NK细胞均发生迅速的活化并产生大量的IFNγ。 3.NKT细胞缺陷对NK细胞的扩增没有影响,但降低了NK细胞的活化水平为了检测在C.pneumoniae感染中NKT细胞是否能够影响NK细胞的活化。首先,我们比较了感染前后野生型小鼠和NKT缺陷小鼠NK细胞数目的变化。我们发现NKT细胞的缺失并没有影响NK细胞的扩增。其次,我们比较了两种小鼠NK细胞活化状态的不同。通过检测感染后NK细胞表面活化标志CD69和CD25的变化,我们发现：感染后第一天起,NKT缺陷小鼠相较与野生型小鼠NK细胞表达CD69的显著降低。同时,NKT细胞缺陷小鼠肺部NK细胞表达CD25也低于野生型小鼠。NKT细胞缺陷对脾脏NK细胞的活化状态的影响与肺部相似。结果说明,C.pneumoniae感染后NKT细胞能够促进NK细胞的活化。 4.NKT细胞缺陷导致了NK细胞产生IFNγ的减少 NKT细胞缺陷导致的NK细胞活化水平的降低不仅表现在NK细胞表型的变化上,NK细胞产IFNγ的功能也受到了影响。感染后,NKT缺陷小鼠来源的肺NK细胞IFNγ的染色阳性率显著低于野生型小鼠。同样,脾脏NK细胞产生IFNγ的水平在NKT缺陷小鼠也有明显的降低。C.pneumoniae肺感染的过程中,NKT细胞促进了感染早期NK细胞产生IFNγ。 5.NKT细胞缺陷影响了NK细胞不同亚型的相对分布比例,但NK细胞产生IFNγ的降低并不局限于特定的NK细胞亚型前面的实验中,我们已经证实了NKT细胞对NK细胞活化程度和IFNγ产生的促进作用,接下来,我们检测了NK细胞功能的改变是否与NK细胞亚型的变化有关。脾脏NK细胞4个亚型的相对百分比在感染前的NKT缺陷小鼠和野生型小鼠间没有区别。而C.pneumoniae感染后,与野生型小鼠相比,NKT缺陷小鼠中CD11blowCD27highNK细胞明显增加,而CD11bhighCD27lowNK细胞明显减少,表明NKT细胞影响了感染后NK细胞的成熟。另外,对NK细胞亚型产IFNγ的检测发现,NKT细胞缺陷显著降低了NK细胞各个亚型IFNγ的阳性率,说明NKT细胞对NK细胞产IFNγ功能的影响是统一的,并不局限于某一特定的亚型。 6.NKT细胞缺陷小鼠来源的DC降低了诱导NK细胞活化的能力树突状细胞作为免疫系统的哨兵在启动免疫应答中发挥关键的作用。DC通过细胞间的接触和可溶性细胞因子诱导NK细胞活化。我们推测NKT缺陷小鼠中NK细胞功能的改变可能是由于DC功能的变化引起的。为验证这一假设,我们进行了DC与NK细胞共培养的体外试验,研究结果显示,与Cpn感染WT小鼠的DC相比,未活化NK细胞与Cpn感染NKT缺陷小鼠的DC共培养时NK细胞产生IFNγ的能力下降。结果说明,DC可能参与了NKT细胞对NK细胞产IFNγ功能的调节过程。 7.NK细胞在宿主抗Cpn呼吸道感染中的作用研究显示,RAG-1缺陷小鼠中,NK细胞对于宿主抵抗C.pneumoniae感染不是必须的。然而最新的一项研究显示,在C.muridarum肺感染中,NK细胞通过对Thl应答的增强作用加强了机体对衣原体感染的抵抗性。在免疫功能完整的野生型小鼠中,NK细胞在宿主抗Cpn呼吸道感染中的作用尚不清楚。因此,我们检测了野生型小鼠的NK细胞在抵抗C. pneumoniae感染中的作用。我们在感染前及感染过程中用anti-Asiola GM1抗体去除NK细胞,研究发现NK细胞的消除加重了Cpn肺感染,与WT鼠相比,NK细胞消除小鼠表现出更严重的体重损失和肺部细菌负荷。以上结果表明,NK细胞在宿主抗Cpn呼吸道感染中起保护性作用。综上所述,本研究得出以下结论：首先,在Cm呼吸道感染模型中,衣原体感染后NKT和NK细胞迅速活化(CD69表达上调)并产生IFNγ,在衣原体感染中NKT细胞能够影响NK细胞的免疫应答,NKT细胞对NK细胞产生IFNγ以及对靶细胞杀伤功能具有不同的调节效应,在这种感染模型中NKT细胞优先的促进了NK细胞IFNγ的产生但是却抑制了其杀伤功能。进一步地,这种对NK细胞不同功能的不同调节作用在不成熟的CD27highCD11blow和终末成熟的CD27lowCD11bhigNK细胞亚群有所体现,但在较成熟CD27highCD11bhighNK细胞亚群中表现的更加显著。另外,在Cpn呼吸道感染模型中NKT细胞同样表现出对NK细胞的调节作用,促进了NK细胞IFNγ的产生。这种调节功能并不局限于某种特定的NK细胞亚型。通过DC与NK细胞共培养的体外试验,我们进一步阐明感染后NKT缺陷小鼠中DC功能的变化可能是导致NK细胞减少IFNγ的产生的原因之一,树突状细胞参与了NKT细胞对NK细胞功能的调节。总之,上述研究结果展示了感染中固有免疫细胞间相互作用的复杂性,对此领域的深入研究不仅能促进我们对衣原体感染这一特定疾病的认识,同时也利于加深我们对于免疫调节的理解,从而以一种更全面的视角来理解不同类型固有免疫或(和)获得免疫细胞之间的相互作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R392

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