免疫细胞细胞胞内死亡特征及机制研究

发布时间：2018-11-25 22:09

【摘要】：Cell-in-cell是指一个或多个活的细胞进到另一个细胞的胞浆内，形成细胞套叠结构的现象，可以发生在同质细胞间，也可以发生在异质细胞间。对这一现象的描述可以追溯到近一百年前，但大多限于现象的报道，直到近年关于肿瘤细胞cell-in-cell胞内死亡被重新命名为entosis[1]，并认为这是一类新型细胞死亡方式，这一现象才重新被认识，并快速成为一个新的研究热点‖。论文作者所在研究团队30年前就发现：NK细胞可以钻入瘤细胞，并从内部杀伤靶细胞，但其自身命运是在瘤细胞内自身降解，而且具有凋亡的典型特征[2]；论文作者在硕士研究期间再次证实了这一发现，并进一步发现NK细胞在瘤细胞内的死亡是caspase通路依赖性死亡[3]，既不同于近年新发现的同质肿瘤细胞间发生的细胞溶酶体通路的细胞胞内死亡-entosis,也不同于细胞自食现象（cannibalism）中瘤细胞吃‖免疫细胞的过程，被学者认为是一种新的细胞胞内死亡现象[4]，我们称之为emtosis（emperipolesis+entosis）。在此基础上，我们进一步扩大对各类不同细胞间发生的cell-in-cell现象进行了探讨，对同质和异质细胞间，特别是免疫细胞-瘤细胞间发生的细胞胞内死亡进行了比较，并重点解析了emtosis形成的机制。此外对于免疫细胞与肿瘤细胞相互作用产生的cell-in-cell现象的临床生物学意义也开展了初步的研究，旨在探索cell-in-cell与临床疾病发生的关系。研究的主要结果如下：细胞胞内死亡是cell-in-cell现象的主要结果，在同质肿瘤细胞或异质肿瘤细胞间发生的细胞胞内死亡主要是溶酶体介导的死亡模式（entosis），而免疫细胞特别是杀伤细胞与肿瘤细胞之间甚至正常细胞之间发生的细胞胞内死亡主要是caspase依赖的凋亡模式（emtosis），但不具备杀伤活性的正常免疫细胞或白血病细胞（B细胞、CCRF、Raji等）在肿瘤细胞内细胞胞内死亡也是溶酶介导的死亡模式即entosis。以上研究结果说明，细胞胞内死亡模式并不限于同质或异质细胞的相互作用，可能与细胞自身特定的生物学性质相关。由于entosis研究所采用的瘤细胞MCF7是一株caspase3缺陷细胞[5,6]，因此在该细胞系间发生的溶酶体介导的细胞胞内死亡（entosis）可能与其caspase3基因缺陷有关[7]。因此，我们分别将此细胞系用于entosis和emtosis的两对瘤细胞之一进行了比较研究。研究结果证实，无论在DNA和mRNA水平、还是在蛋白质水平，MCF7的确是一株caspase3基因缺陷株，不能被经典的凋亡诱导剂staurosporine诱导出现凋亡的各项特征。相反，在emtosis研究中所采用的非caspase3基因缺陷的靶细胞A431株可以被诱导呈现为典型的凋亡特征。两种细胞都可以发生高比例的cell-in-cell现象，主要特征也是细胞胞内死亡，两种细胞出现的细胞胞内死亡均具备典型的entosis特征，与其是否存在caspase3基因缺陷无关。相反，无论进入MCF7还是A431的NK细胞所发生的细胞胞内死亡均为典型的caspase依赖的凋亡，即emtosis，提示胞内细胞以何种形式死亡取决于进入细胞的性质和特征。在上述基础上我们分别对entosis与emtosis形成的机制进行了探讨，结果发现：发生entosis胞内死亡模式的细胞内有氧自由基的明显聚集，并且有线粒体凋亡通路的凋亡因子细胞色素C的释放；胞内细胞和cell-in-cell的空泡结构上有自噬标志性蛋白LC3的聚集；溶酶体功能被抑制后的胞内细胞死亡模式可以从entosis转换成emtosis，并且细胞死亡速度明显提前。以上的证据提示entosis实际上是一个自噬的过程，通过启动自噬通路来抵抗cell-in-cell后内部环境造成的凋亡启动，，以此来获得生存机会，然而持续扩大的自噬行为最终将细胞降解，这一初步结果与2011年Overholtzer实验室研究结论是一致的。但对emtosis机制的研究与entosis有完全不同的结论。我们的研究表明：不同的免疫细胞在肿瘤细胞内发生不同的细胞胞内死亡是与其是否具备杀伤活性密切相关，只有杀伤活性的免疫细胞发生的细胞胞内死亡具备emtosis的特征。进一步采用免疫荧光、颗粒酶B活性抑制剂和颗粒酶B缺陷小鼠来源的杀伤细胞对emtosis的形成机制进行了深入研究。结果表明：（1）无论由人体新鲜分离制备的，还是白血病细胞系来源的免疫样细胞，只有表达颗粒酶B、并具有杀伤活性的免疫细胞才会出现emtosis，而不表达颗粒酶B的免疫细胞如Ｂ细胞、单核细胞等只能发生entosis。（2）颗粒酶B抑制剂处理对emtosis具有非常显著的抑制作用，颗粒酶B缺陷小鼠的LAK细胞发生的emtosis时间上也出现明显延迟。（3）动态观察也发现进入靶细胞内的杀伤细胞可以释放具有活性的颗粒酶B，但颗粒酶B大部分聚集在其自身周围，与靶细胞外杀伤细胞的颗粒酶B扩散至靶细胞胞浆内呈明显反差。因此推测emtosis很可能是由进入胞内的杀伤细胞自我分泌的颗粒酶B 反杀‖所致，这种杀伤细胞的细胞胞内死亡既可能是一种杀伤过程中的误伤，也可能是杀伤细胞自身一种新的平衡和自稳机制。此外，研究结果还发现cell-in-cell所导致的效应细胞和靶细胞的命运是多样的，产生的后果也是多样的：免疫细胞进入肿瘤细胞，或进入正常细胞能明显导致靶细胞形成多核的异倍体细胞；cell-in-cell现象在体外发生的几率比预期的要高，在所筛选的近百余种细胞系中，逾70%的细胞可以出现cell-in-cell现象，而且cell-in-cell还广泛出现在体内包括肿瘤与其癌旁组织在内的各类炎症组织中，为进一步研究cell-in-cell的临床生物学意义提供了基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392.1

【共引文献】