人脐带间充质干细胞向雌性生殖细胞分化的研究

发布时间：2018-11-26 16:52

【摘要】：人脐带间充质干细胞因取材方便，免疫源性低，含量丰富，不涉及社会、伦理及法律等方面的争论等优势，是组织工程理想的种子细胞。利用人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）向生殖细胞的分化在体外建立研究生殖细胞发育分化的模型，对生殖细胞的发生、分化及调控和治疗人类不孕不育症方面具有重要意义。研究证明间充质来源的干细胞在适合的条件下可以向生殖细胞分化，本研究目的在于探究UC-MSCs体内外分化为雌性生殖细胞的潜能。本研究首先鉴定了UC-MSCs的生物学特性，包括其体外培养形态特征、增殖能力、分化潜能（脂肪、骨、软骨、神经和心肌细胞）及间充质干细胞的特性。进一步筛选UC-MSCs的体外培养条件并初步探究促进其增殖的血小板源生长因子（PDGF）对UC-MSCs增殖作用的机理。将培养第9代的人UC-MSCs分别添加不同浓度的PDGF，2，4，6d通过计数统计筛选最佳作用浓度，以最佳作用浓度PDGF作为实验组；以单纯血清培养作为对照组，2，4，6d细胞计数统计观察PDGF的促进增殖作用，并将第9代UC-MSCs传至第16代观察细胞活力。利用RT-PCR技术检测PDGF受体的表达情况，免疫荧光技术和Real Time PCR检测与细胞增殖、细胞周期及多能性基因表达的差异。最后通过细胞周期检测和BrdU掺入试验评价细胞增殖情况。实验结果显示PDGF促进人UC-MSCs的增殖作用呈剂量依赖性。本研究将生殖细胞特异性基因Figlα转入UC-MSCs，进一步通过卵泡液（FF）诱导促进其向卵母样细胞分化。qRT-PCR结果显示转染外源Figlα促进了内源性Figlα、Dazl、Gdf9和Zp2的表达，但未能提高FF的诱导效率。转染Figlα后的雌性UC-MSCs启动了带有GFP荧光的Figlα启动子的表达。20%FF诱导第4d，UC-MSCs逐渐由梭形变成圆形，细胞大小约10μm。14d形成了类卵母样细胞，细胞达到40-50μm（雌性UC-MSCs来源）和25-40μm（雄性UC-MSCs来源）。随诱导时间延长，卵母样细胞未能继续发育，仍然保持40μm大小。通过生殖细胞相关基因的相对定量检测发现：在7d和14d，生殖细胞相关特异性基因的表达量显著高于对照组，但除Dazl外，其它基因随时间延长表达量逐渐升高（雌性UC-MSCs来源），相反，（雄性UC-MSCs来源）随诱导时间延长至14d不仅相关基因表达量没有升高却呈下降趋势（Stra8基因除外）。免疫荧光染色结果显示，14d形成的卵母样细胞呈OCT4，VASA，DAZL，ZP2，ZP3和STRA8阳性。雌激素是卵泡成熟和发育过程中的重要物质，通过检测诱导组雌激素分泌水平发现：诱导3d，7d，14d组明显高于对照组（0d），并且3d时，其雌激素分泌达最高峰。为研究不同性别的UC-MSCs向雌性生殖细胞分化过程中的差异性，检测雄性生殖细胞特化时的基因Sox9和雌性生殖细胞特化时的基因Foxl2在体外诱导条件下向雌性生殖细胞分化过程中表达差异。结果显示诱导的6-9d雌性UC-MSCs，Sox9基因陡然升高，，甚至超过雄性，至第12d又恢复到诱导前较低水平。而Foxl2基因的表达量随着诱导时间延长呈现下降趋势，尤其是在雌性UC-MSCs，Foxl2的表达量自始至终高于雄性。为研究UC-MSCs在体内分化为生殖细胞的能力，将体外经BrdU标记的UC-MSCs分别移植到白消安处理的雄性生殖缺陷模型鼠的曲细精管中和雌性鼠的肾被膜下。30d后通过组织切片的免疫荧光染色鉴定UC-MSCs体内的分化情况，结果显示BrdU阳性UC-MSCs共表达生殖细胞特异性蛋白VASA、DAZL和ZP2。
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【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

【参考文献】