IL-31真核表达载体的构建及其对HaCaT细胞增殖及炎症因子表达的影响

发布时间：2018-12-06 08:23

【摘要】：目的 （1）克隆人白细胞介素-31（hIL-31）cDNA序列，构建pSecTag2/Hygro B-IL-31真核表达载体。 （2）将构建成功的pSecTag2/Hygro B-IL-31真核表达载体转染COS-7细胞，筛选出稳定表达hIL-31的细胞株，分离并纯化hIL-31蛋白。 （3）使用不同浓度的hIL-31作用于HaCaT细胞，，探讨其对IL-6、TNF-α mRNA和蛋白质水平表达的影响。 （4）使用不同浓度的hIL-31作用于HaCaT细胞，探讨其对细胞周期和细胞增殖的影响。 方法 （1）采用淋巴细胞分离液分离获得人外周血单核细胞,培养之后加入终浓度为20nmol/L的PMA，继续培养24h后收集细胞。 （2）Tizol法提取细胞总RNA，RT-PCR扩增hIL-31cDNA序列，并将其构建到真核表达载体pSecTag2/Hygro B上。 （3）使用DNA转染试剂盒将构建成功的pSecTag2/Hygro B-IL-31转染至COS-7细胞当中，并使用潮霉素进行筛选，获得单个克隆后进行扩大培养，采用核酸蛋白检测仪进行蛋白质的分离与纯化。 （4）使用不同浓度的hIL-31干预HaCaT细胞，采用Real-Time PCR的方法分析其对HaCaT细胞IL-6、TNF-α mRNA表达的影响；ELISA法检测其对HaCaT细胞IL-6、TNF-α蛋白表达的影响；MTT法分析其对细胞增殖的影响以及流式细胞仪检测对细胞周期的影响。 结果 （1）经菌落PCR、双酶切及测序分析鉴定,成功获得hIL-31基因cDNA全长序列和pSecTag2/Hygro B-IL-31真核表达载体。 （2）成功筛选出稳定表达hIL-31的COS-7细胞株，并分离纯化出IL-31蛋白。 （3）hIL-31能够显著诱导IL-6、TNF-α mRNA和蛋白水平的表达，并具有时间和剂量依赖效应。 （4）小剂量、短时间的hIL-31抑制HaCaT细胞增殖的作用不明显；高剂量、长时间的hIL-31对HaCaT细胞的增殖有一定的抑制作用。 （5）hIL-31可以改变HaCaT细胞周期，使得G1期细胞数量增加，S期和G2期细胞数量减少。 结论 （1）IL-31可以促进HaCaT细胞IL-6和TNF-α mRNA和蛋白水平的表达。 （2）外源性的IL-31可以改变HaCaT的细胞周期，进而抑制细胞增殖，并且其效应具有时间和剂量依赖性。
[Abstract]:Objective (1) to clone human interleukin-31 (hIL-31) cDNA sequence and construct pSecTag2/Hygro B-IL-31 eukaryotic expression vector. (2) the successfully constructed pSecTag2/Hygro B-IL-31 eukaryotic expression vector was transfected into COS-7 cells, and the cell lines expressing hIL-31 stably were screened out, and the hIL-31 protein was isolated and purified. (3) the effects of different concentrations of hIL-31 on the expression of IL-6,TNF- 伪 mRNA and protein in HaCaT cells were studied. (4) HaCaT cells were treated with different concentrations of hIL-31 to investigate their effects on cell cycle and cell proliferation. Methods (1) Human peripheral blood monocytes were isolated from human peripheral blood by Lymphocyte isolate. After culture, PMA, with final concentration of 20nmol/L was added to culture for 24 hours, and then the cells were collected. (2) the total RNA,RT-PCR of the cells was extracted by Tizol to amplify the hIL-31cDNA sequence and constructed into the eukaryotic expression vector pSecTag2/Hygro B. (3) DNA transfection kit was used to transfect the constructed pSecTag2/Hygro B-IL-31 into COS-7 cells, and hygromycin was used to screen the cells. The protein was separated and purified by nucleic acid protein detector. (4) HaCaT cells were treated with different concentrations of hIL-31, and the expression of IL-6,TNF- 伪 mRNA in HaCaT cells was analyzed by Real-Time PCR, and IL-6,TNF- 伪 protein expression in HaCaT cells was detected by ELISA assay. The effect of MTT on cell proliferation and the effect of flow cytometry on cell cycle were analyzed. Results (1) the full-length cDNA sequence of hIL-31 gene and the eukaryotic expression vector of pSecTag2/Hygro B-IL-31 were successfully obtained by double digestion of colony PCR, and sequencing analysis. (2) COS-7 cell lines expressing hIL-31 stably were successfully screened, and IL-31 protein was isolated and purified. (3) hIL-31 could significantly induce the expression of IL-6,TNF- 伪 mRNA and protein in a time and dose dependent manner. (4) the inhibitory effect of hIL-31 on the proliferation of HaCaT cells was not obvious at low dose and short time, but the proliferation of HaCaT cells was inhibited by high dose and long time hIL-31. (5) hIL-31 could change the cell cycle of HaCaT cells and increase the number of cells in G1 phase, and decrease the number of cells in S phase and G2 phase. Conclusion (1) IL-31 can promote the expression of IL-6 and TNF- 伪 mRNA and protein in HaCaT cells. (2) exogenous IL-31 could change the cell cycle of HaCaT and inhibit cell proliferation in a time and dose-dependent manner.
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329.2

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本文编号：2365742