迟钝爱德华氏菌双组份系统EsrA-EsrB和QseB-QseC的毒力调控机制

发布时间：2018-12-08 08:51

【摘要】：迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种短杆状革兰氏阴性致病菌,能造成多种淡、海水鱼类的系统性出血败血症。E. tarda还是一种重要的人畜共患病原菌,是爱德华氏菌属中唯一感染人类的成员。在感染过程中,E. tarda能以胞内寄生模式定植于宿主重要器官,造成宿主表皮溃烂、脓肿、肠道组织腐败,最终爆发形成爱德华氏菌病。目前,世界各地都有鱼类感染E. tarda的病例报道,造成水产养殖业的严重经济损失。本实验室最新公布的E. tarda基因组测序信息揭示了该病原菌广泛宿主适应,侵染及毒力等方面的遗传学基础。本课题基于对E. tarda毒性分离株EIB202在动物、细胞模型中致病力的综合分析,初步筛选获得与细菌双组分系统和分泌系统相关的减毒疫苗候选靶位。在此基础上,鉴定了EIB202毒性因子T6SS、TTSS和溶血素在致病过程中的作用,揭示了双组分系统EsrA-EsrB介导的外界环境条件对细菌T6SS和溶血素的调控机制,探索了新型跨界群体感应系统QseB-QseC对E. tarda菌体表面结构介导的广宿主适应性及体内生存的调控作用,初步总结绘制了E. tarda的毒性调控网络。本研究首先研究了E. tarda EIB202的致病特性发现实验室条件下E. tarda EIB202对斑马鱼、牙鲆的半致死剂量相近,而且受感染宿主发病特征典型。细胞模型考察发现,E. tarda EIB202具有显著的上皮细胞感染能力,能通过内化作用进入宿主细胞,其内化比率较E. coli高22倍。此外,E. tarda EIB202还能利用Ⅲ型和Ⅵ型分泌系统对抗macrophage J774a的天然杀伤作用,在胞内维持稳定增殖,其胞内增殖率较E. coli高9倍,揭示EIB202造成动物感染和细胞损伤的致病特征,初步证明由分泌系统以及双组分系统组成的毒力调控网络在E. tarda致病过程中的重要作用。基于对E. tarda EIB202毒力特征的初步认识以及其全基因组信息,本研究选择10个涉及毒力、代谢、调控、分泌系统、压力应激、群体感应等相关的靶位基因,利用无标记框内缺失技术构建获得缺失突变菌株AaroC、AesrB、AtorR、AkatB、WED、AmgtB、AethA、AsodC、AclpB和AedwR。经累积致死率和初步免疫保护评估发现,具有典型营养缺陷型特征的AaroC菌株减毒效果明显,并能激起斑马鱼免疫反应,达到68%的免疫保护效果。此外,AesrB和WED菌株也具有良好的减毒效果,在斑马鱼免疫中达到80%和81%的免疫保护效果。本研究考察了E. tarda毒力元件的生理功能并建立其毒力相关调控网络。Ⅵ型分泌系统是细菌中分布较广、毒力特征明显的重要分泌组件。本研究比较了不同分离菌株中的E. tarda VI型分泌系统特有元件EvpP的分布,发现鳗源Aeromonas hydrophila 0865携带有与E. tarda的evpP基因相似度很高的编码序列,暗示evpP基因甚至Ⅵ型分泌系统可能通过水平转移在不同菌株间传递。此外,利用流式细胞术进行evpP启动子活性分析,进一步揭示双组分系统EsrA-EsrB能激活EvpP及T6SS元件表达,而Fur蛋白介导的铁离子调控则抑制了EvpP及T6SS元件的表达。基于动物和细胞模型,进一步考察了EvpP元件在E. tarda宿主感染中的作用,发现evpP基因缺失菌株丧失体内特别是免疫器官内的寄生增殖能力,而且显著削弱了内化进入EPC细胞的能力,证明EvpP在E. tarda的宿主感染机制中发挥了关键作用,并受到双组分系统EsrA-EsrB和Fur蛋白的调控。双组分系统是细菌响应环境应激并控制基因表达的信号转导系统,在细菌致病机制中发挥着重要作用。本研究发现,阻断E. tarda双组分系统EsrA-EsrB效应元件EsrB,产生了良好的减毒效果,却增强了菌株对宿主和细胞的侵染能力。通过比较不同组分的细胞毒性发现培养上清具有较高的细胞毒性。经SDS-PAGE电泳分析发现AesrB菌株增强表达了一个分子量为147 kDa的组分。MALDI-TOF鉴定该组分为溶血素前体蛋白EthA,说明E. tarda溶血素的表达受到双组分系统EsrA-EsrB的调控。随后发现E. tarda AesrB菌株的溶血活性及溶血素表达呈现典型的温度诱导性。基于全基因组测序信息及EMSA鉴定,本研究确证核酸结合蛋白Hha能通过直接结合到溶血素前体ethA启动子上游,响应胞外环境应激调控基因表达。最新鉴定的细菌跨界群体感应系统能响应宿主激素信号肾上腺素和去甲肾上腺素,并显著影响细菌的感染致病力。作为具有广泛宿主适应性的兼性胞内寄生菌,E. tarda进化出多种菌体表面结构(鞭毛、纤毛和分泌系统)以实现宿主感染。本研究鉴定了E.tarda中跨界群体感应系统QseB-QseC系统,通过同源重组将qseB和qseC进行的框内缺失,发现E. tarda QseB-QseC系统调控了鞭毛介导的运动能力、纤毛介导的甘露糖抑制型血细胞凝集能力及Ⅲ型分泌系统介导的胞内寄生能力。进一步分析发现,肾上腺素信号能通过QseB-QseC系统影响鞭毛介导的运动性及TTSS元件介导的胞内寄生能力。此外,本研究也首次利用分子进化模型对E. tarda中新型跨界群体感应系统QseB-QseC进行了进化分析,发现受体元件QseC的进化显然受到环境压力选择的影响,暗示了E. tarda广泛宿主适应能力是在宿主及环境压力中选择进化的结果。
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【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R378;S941

【参考文献】