BCCIP相互作用蛋白的鉴定与功能研究

发布时间：2018-12-11 21:49

【摘要】：BCCIP是一个与BRCA2和p21相互作用的蛋白质，BCCIP在细胞有丝分裂、细胞周期调控、DNA同源重组修复、基因组稳定性等方面起着重要作用。但是BCCIP确切的作用机制并不清楚，为了进一步探讨BCCIP的功能和作用机制，本课题采用免疫共沉淀和双酵母杂交等实验方法寻找鉴定与BCCIP相互作用的蛋白，并对其功能进行初步研究。 1.在前期研究工作的基础上，用Flag标签连接在BCCIPβ N端的外源性蛋白Flag-BCCIPβ，在HT1080细胞内可以与内源性的PAK1IP1蛋白免疫共沉淀，初步鉴定出PAK1IP1与BCCIPβ存在相互作用； 2.构建了Flag标签连接在BCCIP C端的pOZ-FH-C1-BCCIP质粒，转染Hela细胞后所表达的外源性蛋白BCCIPβ-Flag可以拖下内源性的PAK1IP1蛋白，进一步确定PAK1IP1与BCCIPβ的相互作用； 3.构建了PAK1IP1的原核表达载体pET-28b-PAK1IP1，在原核生物大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组蛋白GST标记的BCCIP与His标记的PAK1IP1的免疫共沉淀实验，发现用GST-BCCIP可以拖下His-PAK1IP1，初步鉴定PAK1IP1与BCCIPβ的相互作用可能是直接的； 4.构建Flag标记的PAK1IP1全长质粒和7个不同片段的质粒，转染Hela细胞后进行免疫共沉淀实验，发现外源性PAK1IP1全长蛋白可以拖下内源性的BCCIP蛋白，从反方向再次证明PAK1IP1与BCCIPβ发生相互作用；应用构建的PAK1IP1的7个不同片段蛋白进行免疫共沉淀实验，确定了PAK1IP1蛋白C末端的330到392氨基酸是与BCCIPβ的相互作用区域； 5.构建稳定表达Flag标记的BCCIP N端1到167氨基酸片段和1到258氨基酸片段的2个细胞系，通过免疫共沉淀实验确定BCCIP蛋白N末端1到167氨基酸是与PAK1IP1的相互作用区域； 6.设计针对PAK1IP1的shRNA，连接入pSilencer5.1-U6逆转录病毒载体，转染病毒包装细胞，收集病毒上清感染HT1080细胞，嘌呤霉素筛选得到稳定的PAK1IP1蛋白表达下调的单克隆细胞株； 7.应用上述细胞株进行PAK1IP1的功能研究发现，PAK1IP1下调会引起HT1080细胞的生长减慢，但是不会影响BCCIP蛋白表达水平和蛋白细胞内定位的变化；细胞照射后的γ-H2AX分析和平板克隆形成实验结果证明PAK1IP1下调并不引起HT1080细胞放射敏感性的改变； 8.应用酵母双杂交法筛选到3个与BCCIP相互作用的文库质粒，经测序鉴定，与BCCIPα相互作用的文库质粒是增殖细胞核抗原（PCNA）和FAM46A，，与BCCIPβ相互作用的文库质粒是PCNA。其中，FAM46A是首次发现的与BCCIPα相互作用蛋白，为BCCIP功能和作用机制的研究提供了新的方向。结论： 1.发现BCCIPβ新的相互作用蛋白PAK1IP1，两蛋白间的相互作用可能是直接的；确定PAK1IP1C末端的330到392氨基酸和BCCIP N末端1到167氨基酸是两者相互作用的区域； 2.用逆转录病毒载体介导的shRNA在HT1080细胞成功构建了PAK1IP1蛋白表达下调的模型；PAK1IP1下调会引起HT1080细胞的生长减慢，但是不会影响BCCIP蛋白表达水平和蛋白细胞定位的变化，并且PAK1IP1与放射敏感性无关； 3.双酵母杂交法鉴定出PCNA和Fam46A与BCCIP相互作用，其中，FAM46A是新发现的与BCCIPα相互作用蛋白，为BCCIP功能和作用机制的研究提供新的方向。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R341

【参考文献】