不同洗涤离心力对脐血间充质干细胞纯化的影响

发布时间：2018-12-14 04:05

【摘要】：目的：由于间充质干细胞（MSCs）对于人类疾病治疗具有潜在的、可预期的重大影响，近年来，许多学者致力于应用MSCs治疗疾病的基础与临床研究，其中，以脐血间充质干细胞（UCB-MSCs）的研究为主导。目前，UCB-MSCs已被成功诱导分化为多种组织细胞，不少学者也对UCB-MSCs的分离纯化技术进行了探索，对其培养方法、培养条件进行了诸多的改良和优化，但在不同洗涤离心力对UCB-MSCs纯化的影响方面却鲜见报道。笔者在进行UCB-MSCs培养时，反复使用大部分学者采用[1]的1500r/min离心10min（r=15cm，相对离心场RCF=378g）洗涤技术，始终未能获得满意的细胞贴壁及生长结果，分析认为是由于该洗涤方法所得到的细胞纯度不高所致。由于不同离心力洗涤对于干细胞纯化的影响举足轻重，故有必要对其进行深入的研究。本实验在其它实验条件不变的基础上，首先将脐血离心并有效分层，然后使用不同离心力洗涤，观察对比不同洗涤离心力对UCB-MSCs纯化的影响，以期寻找出更有利于干细胞纯化的适宜洗涤离心技术，为UCB-MSCs培养提供更好的基础条件。方法：选择满足UCB-MSCs采集适应症的孕妇8名，无菌采集脐血约40ml。首先以1:1比例用0.9%生理盐水将脐血稀释，然后按照1:1比例将稀释后脐血缓缓加入淋巴细胞分离液（1.077g/ml）中，，2000r/min离心20min（671g），将脐血有效分层。轻轻吸取中间白膜层约30ml，添加0.9%生理盐水至50ml后混匀，将其平均分为5份，每份10ml，分别以1500r/min离心10min（378g）、1300r/min离心10mi（n284g）、1200r/min离心10min（242g）、1000r/min离心10min（168g）、800r/min离心10min（107g），洗涤后均弃上清液，余细胞沉淀约0.5ml，加入L-DMEM-10%胎牛血清-庆大霉素培养基至10ml，混匀后分别接种于T25培养瓶，倒置相差显微镜下观察（放大倍数10×20），选取混杂物质数量居中的视野，对比每组混杂物质的差异并行图像采集，使用多项目自动血球分析装置(XT-1800i)分析每份细胞悬液，记录其单个核细胞（MNCs）密度（10~9/L）、红细胞（RBCs）密度（10~9/L）、血小板（PLT）密度（10~9/L）、MNCs率（%），使用SPSS15.0统计学软件进行统计学分析，并绘制曲线图。另外，移液枪吸取每份细胞悬液一滴涂片，行瑞氏染色，于油镜下观察杂质情况并采集图像。在细胞接种后第7天弃全部培养液，倒置相差显微镜下观察，于各接种瓶中选取贴壁细胞数量居中的的视野5个，分别计数后行方差分析，并观察对比梭状细胞数。细胞接种后第14天，分别观察每瓶细胞生长情况，选取生长情况居中的视野采集图像。结果：1、比较不同离心力洗涤后接种当时在倒置相差显微镜下观察到的情况，1500r/min洗涤、1300r/min洗涤接种瓶中除大量细胞外，可见大量混杂物质，而1200r/min洗涤、1000r/min洗涤、800r/min洗涤接种瓶中除大量细胞外，混杂物质明显低于前两者，800r/min洗涤接种瓶尤为显著，将细胞悬液涂片行瑞氏染色后于油镜下观察（放大倍数10×1000），结果同倒置相差显微镜下观察。2、将不同离心力洗涤后所得的MNCs密度（10~9/L）、RBCs密度（10~9/L）、PLT密度（10~9/L）、MNCs率（%）绘制成曲线图，并行方差分析，其中MNCs密度（10~9/L）随洗涤离心力降低有降低的趋势、MNCs率（%）随洗涤离心力降低有升高的趋势，但二者的差别均不具有统计学意义（P0.05），PLT密度（10~9/L）、RBCs密度（10~9/L）随洗涤离心力降低有降低的趋势，其数据差异具有统计学意义（P0.05）。3、细胞接种后第7天，于各接种瓶中选取贴壁细胞数量居中的的视野5个，分别计数后行方差分析，其差异具有统计学意义（P＜0.05），观察对比梭状细胞数，800r/min洗涤的各接种瓶中，梭状细胞数≥5个/视野的约有5-8个视野，1200r/min洗涤、1000r/min洗涤的各接种瓶中约有1-3个，1500r/min洗涤、1300r/min洗涤的各接种瓶中无满足条件的视野。4、接种14天后倒置相差显微镜下观察，800r/min洗涤的接种瓶中细胞生长情况相对最佳，2-5个视野下可见梭状细胞融合抱团生长（抱团细胞数≥7个/视野），其余接种瓶从未见抱团生长情况，且细胞趋于死亡。结论：1.在使用淋巴细胞分离液（1.077g/ml）进行密度梯度离心法分离提纯UCB-MSCs时，目前普遍采用的1500r/min离心10min（r=15cm，相对离心场RCF=378g）洗涤法所获得的细胞纯度不高，其中含大量混杂物质，不利于UCB-MSCs贴壁、生长和分化，低离心力洗涤可使UCB-MSCs纯度大大提高，利于UCB-MSCs贴壁和生长、分化，800r/min离心10min洗涤效果最佳；2、在使用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心法分离提纯UCB-MSCs时，RBCs残余量对UCB-MSCs贴壁的影响远远低于PLT残余量对其的影响，PLT残余量可能才是影响UCB-MSCs贴壁的最主要因素，在洗涤细胞时应着力去除。
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【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

【参考文献】