CHL1基因敲除小鼠抗缺氧损伤过程中颈动脉体的调节作用

发布时间：2018-12-20 07:30

【摘要】：机体在低氧环境下将发生一系列代偿性的反应,来维持体内氧浓度的平衡。颈动脉体(carotid body,CB)作为机体重要的外周氧感知化学感受器,当外界氧浓度发生变化时,CB可以迅速感知机体内氧分压的变化,通过释放神经递质,产生神经冲动,继而引起机体对低氧的应答包括:心率增加,呼吸加深加快等生理反应,以对抗PO2的降低,使机体能在缺氧环境中得以适应并生存。颈动脉体由I型细胞(球细胞)和II型细胞(支持细胞)组成。I型细胞起源于神经外胚层,类似于交感神经元,能够释放乙酰胆碱、多巴胺等神经递质。I型球细胞作为CB的功能细胞在机体感知低氧的过程起重要的作用。因此,颈动脉体是感知低氧刺激使机体产生适应和调节的重要器官。细胞粘附分子CHL1(close homologue of L1,CHL1)是一种跨膜蛋白,属于粘附分子免疫球蛋白超家族成员,与神经粘附分子L1高度同源。目前,关于细胞粘附分子CHL1的研究主要集中在神经系统中的轴突生长、神经元迁移、学习和记忆等方面。CHL1基因缺失小鼠可以正常的存活和繁殖,但在神经突起的发育和成年后的学习和记忆方面存在一定的缺陷。我们实验室前期的研究显示CHL1缺失可通过激活ERK信号通路调节体外培养的神经干细胞的增殖,CHL1是神经干细胞增殖的负调控因子。最近的研究发现CHL1基因缺失小鼠给予严重的低氧处理后,该基因敲除小鼠较野生型小鼠的存活率和存活时间都明显延长,表明CHL1基因缺失小鼠具有明显的抗缺氧损伤能力。那么,CHL1基因缺失是如何提高小鼠抗急性缺氧的能力?作为在急性缺氧时具有重要调节作用的颈动脉体是否参与了此调节过程?CHL1的缺失又是如何调节颈动脉体的结构和功能?就这些问题,我们进行了研究。主要研究结果如下: 一、CHL1基因敲除小鼠的抗低氧特性将雄性CHL1基因敲除小鼠和野生型小鼠放置低氧舱内进行急性低氧(O2浓度5%),观察小鼠的存活率和存活时间。结果显示:400s内CHL1基因敲除小鼠的存活率为60%,明显高于野生对照组10%的存活率。统计结果表明CHL1基因敲除小鼠的存活率和存活时间较野生型小鼠明显增加。该结果提示CHL1基因缺失可以明显提高小鼠对低氧的耐受能力。二、CHL1在颈动脉体中的表达和定位颈动脉体中主要含有酪氨酸羟化酶(TH)免疫反应阳性的球细胞和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)或巢蛋白(Nestin)免疫反应阳性的支持细胞。其中I型球细胞成簇分布,II型支持/过渡态细胞分布于球细胞周围。通过对颈动脉体组织和体外分离培养的CB细胞进行免疫荧光染色,检测CHL1在颈动脉体中的表达分布和共定位情况。结果显示: 1. CHL1在颈动脉体中有广泛的表达,主要定位于TH~+球细胞的胞膜和周围支持细胞的胞膜、胞浆中。CHL1与TH~+的细胞,及GFAP/Nestin~+细胞都有共定位。因而,CHL1在颈动脉体的两种不同的功能细胞中均有表达,提示其可能在低氧对颈动脉体的调节中发挥重要的作用。 2.分离的原代颈动脉体细胞中,主要的细胞类型可分为TH~+的球细胞和GFAP/Nestin~+的支持细胞。CHL1在0d时主要在TH~+的胞浆中分布,3d时CHL1主要集中在TH~+的胞浆、胞核中。而在0d和3d培养的GFAP~+细胞中,CHL1主要在胞浆中。因此,CHL1在两种类型的细胞中均有表达,但表达分布有所不同。三、CHL1基因缺失对小鼠颈动脉体形态结构的影响为了探讨CHL1基因敲除小鼠对低氧耐受性增强的原因,我们进一步观察了CHL1的缺失对小鼠颈动脉体形态和结构的影响。 1.分离CHL1基因敲除小鼠和野生型小鼠的颈动脉体进行免疫荧光或组化染色。结果显示:CHL1缺失后颈动脉体细胞总数增加,TH~+细胞的总数目较野生型明显增多。提示CHL1基因缺失导致颈动脉体体积增大,TH~+细胞数目增加。 2.我们利用Western Blot方法从蛋白表达水平进行了进一步验证。野生型小鼠颈动脉体中,可以检测到165KD和185KD的CHL1蛋白条带,CHL1基因缺失小鼠CB中不能检测到CHL1的表达。在CHL1基因敲除小鼠颈动脉体中,作为球细胞标志性蛋白的TH表达量明显高于野生型小鼠;而GFAP和Nestin表达量无明显差异。四、CHL1基因缺失对颈动脉体功能的影响为了研究CHL1缺失是否影响颈动脉体的功能,我们观察了野生型和CHL1基因敲除小鼠在急性缺氧时呼吸频率和肺通气量的变化,以及缺氧时颈动脉体窦神经的放电的变化。 1.利用BUXCO动物肺功能仪的体描箱,同时记录了野生型和CHL1基因敲除小鼠在急性缺氧时的呼吸频率和肺通气量,结果显示:在正常条件下CHL1基因敲除和野生型小鼠的呼吸频率没有明显区别,但急性缺氧后CHL1基因敲除小鼠的肺通气量和呼吸频率较野生型明显增加。 2.颈动脉体的感觉传入神经为窦神经,通过其传入神经窦神经的放电频率的变化向中枢神经系统进行信息传递。为了进一步证明CHL1基因敲除小鼠抗缺氧能力与颈动脉体的直接关系,我们记录了CHL1基因敲除小鼠缺氧时颈动脉体窦神经放电的变化。低氧刺激后CHL1基因敲除小鼠CSN放电的频率较野生型小鼠明显增强。五、急性低氧对CHL1在其它组织表达的影响为了阐明CHL1缺失小鼠的抗缺氧作用,我们还检测了CHL1在其它重要器官如心脏、肺、肾和脑等组织中的表达,及低氧后的影响。我们对野生型小鼠进行8%氧浓度低氧处理8h,提取小鼠不同部位的蛋白进行Western blot检测,结果如下: 1.急性低氧后CHL1在大脑皮层、脑干和下丘脑部位的表达明显低于常氧组,而小脑部位CHL1的表达明显增加,海马和丘脑部位CHL1表达变化不明显。 2.研究发现CHL1在心脏、肺、肾等组织中也有较高的表达,急性低氧后CHL1蛋白在心、肺组织中的表达较常氧组明显降低,在肾组织中的表达没有明显改变。CHL1在心肺肾等组织中的表达提示可能参与了抗低氧作用的调节,然而其作用尚待进一步的研究。综上所述,该研究首次探讨了CHL1在低氧损伤过程中对颈动脉体的调节作用。研究发现CHL1基因敲除小鼠的低氧耐受能力明显增强,可能通过调节颈动脉体TH~+细胞数目,使传入神经窦神经的放电频率增加,进而提高机体对急性缺氧时呼吸反应而改变肺通气密切相关。CHL1在其它重要器官如心脏、肺、肾和脑等组织中的表达,及低氧后的变化,提示有可能参与了CHL1基因敲除小鼠抗缺氧的调节,尚有待于进一步的研究。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R363

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