【摘要】：研究背景和目的： 炎症性肠病(inflammatory bowel diseases, IBD)是一种遗传因素、环境因素和免疫因素共同参与的肠道慢性非特异性炎症性疾病。包括克罗恩病(Crohn's disease,CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC),呈间歇性反复发作。IBD在欧美的发病率高于发展中国家,但近年来我国的IBD发病率明显上升。虽然目前IBD病因学和发病机制仍未明确,但越来越多的证据支持Th1/Th2型反应失衡介导的免疫异常在炎症性肠病发病中起重要作用。根据所分泌细胞因子和介导免疫功能的不同,CD4+T细胞可分为1型辅助性T细胞(Thl细胞)和2型辅助性T细胞(Th2细胞)两型。Thl型细胞主要分泌干扰素-γ(interferon-γ,IFN-y)、白介素-2(interleukin-2,IL-2)和肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α),Th2型细胞分泌白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)和白介素-10(IL-10)。CD的免疫类型主要偏向于Th1型,而UC主要是Th2型疾病。 细胞因子分为促炎因子和抑炎因子。促炎因子和抑炎因子的失衡在炎症性肠病的发生和发展中起重要作用。促炎因子如白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、TNF-α和IFN-γ等由单核细胞和巨噬细胞分泌,参与细胞免疫；抑炎因子如IL-4、IL-5和IL-10等由T细胞分泌,参与体液免疫反应。其中,IL-10和IL-4是最重要的两种抑炎因子。 IL-10可由多种细胞产生,包括T细胞(CD4+和CD8+)、B细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞。由1号染色体上的五个外显子编码。IL-10能抑制TNF-α、INF-γ、IL-6等促炎因子的产生。IL-10对IL-1和TNF-a产生的抑制效应是其抗炎活性的关键所在,在细胞免疫中作为一种重要的负调节因子,能抑制炎症细胞的活化,对抗炎症因子引起的损害。IL-10对IBD的保护作用已经被广泛证实。在小鼠模型中,敲除IL-10基因可诱发由Thl细胞介导的类似于人类CD的自发性结肠炎。在各种动物试验中,给予IL-10蛋白制品或分泌IL-10的基因工程菌如乳酸杆菌等可预防IBD或减轻已发生的肠道炎症。 人的IL-4是分子量约20KD的糖蛋白,成熟的IL-4分子由129个氨基酸组成,编码IL-4分子的基因位于第5号染色体上,由4个外显子和3个内含子组成。其基因长度约为10Kb,是已知的人的淋巴因子中最长的。在小鼠中,IL-4主要由激活的淋巴细胞合成,可以抑制其他促炎因子如IL-1、IL-6、IL-8及TNF-a产生,还可以诱导IL-1α的产生,提高IL-1ra/IL-1的比值,具有较强的抗炎功能,对维持肠道免疫起重要作用。作为Th0细胞向Th2细胞分化的主要诱导因子,IL-4可调节Th1/Th2细胞平衡,抑制Thl型炎症性疾病。许多体内外细胞培养实验发现UC患者的IL-4分泌细胞数下降,IL-4mRNA的表达及蛋白分泌明显减少。但是,另外一些研究却发现IL-4也能通过上调IFN-γ、TNF-α的表达促进Thl型反应。由此可见,IL-4在细胞免疫中发挥的作用是复杂的,其在IBD中的作用机制尚未完全阐释清楚。 IBD动物模型包括转基因模型、免疫学模型和化学性炎症模型。其中三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonic acid,TNBS)诱导的化学性炎症模型是实验研究中常用的模型。TNBS是一种半抗原物质,多与乙醇合用造模。乙醇破坏肠黏膜屏障后,TNBS与结肠组织蛋白结合形成完全抗原,导致肠黏膜发生迟发性变态反应,从而造成肠黏膜的损伤。此模型可诱发Thl型免疫反应,类似人类CD。TNBS造模法虽然缺乏特征性急性期表现,而且动物死亡率高,但操作简单、经济实用、重现性好、造模时间短、病变持续时间较长,能体现急性炎症向慢性转化的动态过程,是一种经典的动物模型,适用于研究IBD的发病机制和筛选新的药物靶点。 IBD传统治疗方法包括5-氨基水杨酸制剂、糖皮质激素和免疫抑制剂等,但是传统药物有效性和安全性均具有一定程度的局限性,且停药后容易复发,最终需要手术治疗的患者比例较高,患者的生活质量仍受到一定的影响。随着对IBD发病机制研究的深入,生物制剂治疗成为研究的新方向。如肿瘤坏死因子-α(TNF-a)在IBD的发病机制中是一个关键的细胞因子,在炎症反应的起始和扩大中发挥重要的作用。在UC和CD患者的小肠粘膜中TNF-a含量明显增加,而且与炎症的活动性相关。英夫利昔(Infliximab,一种IgG1鼠/人嵌合型抗TNF-a单克隆抗体)是一种最有效的诱导和维持治疗活动性和具有瘘管的克罗恩病的生物学制剂,而且是目前惟一被美国食品和药物管理局(Food and drug administration, FDA)批准用于治疗IBD的生物学制剂。然而,英夫利昔也存在免疫原性的限制,可导致输液反应和降低疗效。其不良反应还包括延迟的高血压反应、药物诱导的狼疮、脱髓鞘、非霍奇金淋巴瘤、充血性心力衰竭和严重机会性感染。另外,肠道外给药方式也不利于患者长期给药,并且对UC疗效不明显。 基因治疗通过基因转移技术使机体表达相关免疫保护蛋白质,从而下调致病的炎症和免疫反应,上调保护性反应。局部给予经包装的质粒、脂质体、逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体均能将目的基因转导至肠道黏膜并持续表达目的基因。上述载体中,以AAV载体系统的转导效率高,应用前景最广阔。重组AAV(reconstructed AAV,rAAV)载体去除了所有编码序列,只保留145bp的末端重复序列,不含任何病毒基因。但是腺病毒载体系统相对脂质体等非病毒载体系统,具有以下缺陷：有免疫原性；插入的目的片段大小受限制；当治疗慢性疾病时,病毒基因可能整合至宿主基因组中,从而激活病毒导致感染风险。 基于以上的研究背景,本研究探讨了脂质体介导的小鼠白介素-4(murine interleukin-4, mIL-4)和小鼠白介素-10(nurine interleukin-4, mIL-10)转基因治疗对TNBS诱导的小鼠炎症性肠病的作用。内容包括： 1构建真核表达载体pcDNA3.0-mIL-4和pcDNA3.0-mIL-10。 2通过酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和聚丙烯酰胺凝胶电泳法(Western blotting)验证pcDNA3.0-mIL-4、pcDNA3.0-mIL-10在体外的表达。 3构建TNBS诱导的小鼠炎症性肠病模型。 4经腹腔注射给予脂质体(LipofectAMINE2000reagent, Liposome)包裹的pcDNA3.0-mIL-4、pcDNA3.0-mIL-10或者pcDNA3.0-mIL-4+pcDNA3.0-mIL-10二者混合物,1周后处死小鼠,并取远端结肠组织行HE染色病理学检查、ELISA法检测结肠粘膜中促炎因子IFN-γ表达、实时荧光定量PCR检测TNF-a和IL-6的表达水平以观察疗效。方法 1.聚合酶链反应法(Polymerase Chain Reaction, PCR)扩增iIL-4、mIL-10基因,连接真核表达载体pcDNA3.0,构建真核表达质粒pcDNA3.0-mIL-4和pcDNA3.0-mIL-10。 2.重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过ELISA法或Western blotting方法验证mIL-4和mIL-10在体外的表达。 3.用TNBS制备小鼠IBD模型：将70只雄性BALB／c小鼠随机分为正常对照组(Vehicle组)和处理组：pcDNA3.0-mIL-4组(Liposome/IL-4)、pcDNA3.0-mIL-10组(Liposome/IL-10)、pcDNA3.0-mIL-4+pcDNA3.0-mIL-10组((Liposome/IL-4+IL-10))、TNBS组、pcDNA3.0组Liposome组,每组10只。处理组小鼠以100u1的TNBS乙醇溶液灌肠,正常对照组小鼠以100u1的50%乙醇灌肠。处理组小鼠于造模后24小时经腹腔注射给予脂质体包裹的pcDNA3.0-mIL-4、pcDNA3.0-mIL-10.pcDNA3.0-mIL-4+pcDNA3.0-mIL-10、pcDNA3.0或Liposome,于第7天处死。每日观察各组小鼠疾病活动度、体重百分比变化。 4.取远端结肠组织并切片行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE),用光学显微镜观察小鼠结肠病理学变化。 5.酶联免疫吸附法检测各组小鼠结肠黏膜中IFN-γ水平的变化。 6.实时荧光定量PCR (quantitive real time PRC,qRT-PCR)检测各组小鼠结肠黏膜中TNF-α mRNA、IL-6mRNA表达的变化。 7.统计学处理：采用SPSS13.0软件进行统计学分析：如果数据服从正态分布,以x±S表示,进行单向方差分析,若方差分析显著时再行多重比较,方差齐性时行LSD法多重比较,方差不齐时行Dunnett's T3法多重比较；如果数据不服从正态分布,以中位数表示,进行多个独立样本的非参数检验；疾病活动度、体重变化数据进行重复测量方差分析。P0.05为差异有统计学意义。 结果 1.PCR扩增出预期大小的目的片段mIL-4、mIL-10,与真核表达载体pcDNA3.0连接,构成pcDNA3.0-mIL-4和pcDNA3.0-mIL-10重组质粒；经酶切鉴定、测序分析证实重组质粒构建成功。 2.ELISA法鉴定mIL-4在体外成功表达,Western blotting法鉴定mIL-10在体外成功表达。 3.经腹腔注射给予脂质体包裹的重组质粒pcDNA3.0-mIL-4和pcDNA3.0-mIL-10均可在小鼠体内表达。4.Liposome/IL-4、Liposome/IL-10处理组小鼠疾病活动度指数(DAI)评分均低于TNBS组,Liposome/IL-4+IL-10处理组小鼠疾病活动度指数(disease activity index, DAI)评分与TNBS组接近。 5.各处理组小鼠的体重在第2、3天时下降最显著,而Liposome/IL-4Liposome/IL-10处理组小鼠体重从第3天开始回复,至第7天大部分恢复正常；而Liposome/IL-4+IL-10处理组和TNBS组小鼠体重持续下降。 6. Liposome/IL-4、Liposome/IL-10处理组小鼠结肠组织学评分均低于TNBS组(x2=37.118,P0.001),结肠肠壁结构完整,结肠粘膜少量炎性细胞浸润；TNBS模型组、Liposome/IL-4+IL-10处理组小鼠结肠粘膜上皮缺损,杯状细胞减少,粘膜下层水肿,肠壁全层炎细胞浸润。 7. Liposome/IL-4、Liposome/IL-10、Liposome/IL-4+IL-10组IFN-γ浓度均低于TNBS组,但Liposome/IL-4+IL-10组IFN-γ浓度高于Liposome/IL-4组和Liposome/IL-10组(x2=34.148, P0.001). 8. Liposome/IL-4、Liposome/IL-10、Liposome/IL-10-4+IL-10组与TNBS组小鼠相比,结肠黏膜TNF-a mRNA、IL-6mRNA的表达水平均下调(P0.05)。结论 本研究构建了真核表达质粒pcDNA3.0-mIL-4和pcDNA3.0-mIL-10探讨了脂质体介导的IL-4、IL-10或IL-4联合IL-10转基因治疗对TNBS诱导的IBD模型的影响。通过研究得出以下结论： 1.重组真核表达质粒pcDNA3.0-mIL-4和pcDNA3.0-mIL-10在体内、体外均可表达。 2.IL-4和IL-10转基因治疗TNBS诱导的IBD疾病活动度和结肠炎症减轻。IL-4联合IL-10治疗不能减缓IBD疾病活动度和减轻结肠炎症。 3.IL-4和IL-10转基因治疗明显下调促炎因子IFN-γ、TNF-a、IL-6的表达,而IL-4联合IL-10治疗可下调部分促炎因子的表达,但效果明显弱于IL-4或IL-10单独作用。 4.IL-4、IL-10单独转基因治疗IBD有效,而联合使用IL-4、IL-10疗效甚微。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R574;R-332
【共引文献】
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本文编号：
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