补体调节蛋白CD59 CD46在T细胞活化信号转导中的作用研究

发布时间：2018-12-25 09:56

【摘要】：目的：本研究采用siRNA技术,构建pSUPER-siCD46重组质粒,与本室保存的pSUPER-siCD59重组质粒,观测CD46和CD59特异性沉默对T细胞信号转导的影响,旨在探讨CD59与CD46在T细胞信号转导中的协同效应。 方法：构建pSUPER-siCD46重组质粒,利用PCR、质粒双酶切及DNA测序对其进行鉴定。应用阳离子脂质体法转染Jurkat细胞,将细胞分为未转染的Jurkat细胞(Ⅰ组)、转染pSUPER空质粒Jurkat细胞(Ⅱ组)、转染pSUPER-siCD59重组质粒Jurkat细胞(Ⅲ组)和转染pSUPER-siCD46重组质粒Jurkat细胞(Ⅳ组),G418筛选稳定表达的细胞克隆。采用RT-PCR、 Westernblot检测各组细胞中CD46和CD59基因的表达。应用CD59、CD46的单克隆抗体联合作用于各组Jurkat细胞,MTT法测细胞增殖、Western Blot测ZAP-70磷酸化的水平。结果：经PCR、限制性内切酶双酶切及测序鉴定,结果表明重组质粒序列插入正确。重组质粒pSUPER-siCD59和pSUPER-siCD46分别转染的Jurkat细胞,可表达绿色荧光蛋白,经G418筛选,得到阳性细胞克隆；RT-PCR结果显示：Ⅲ组CD59mRNA和Ⅳ组CD46mRNA的表达均被明显抑制,与Ⅰ、Ⅱ组相比较(P0.05),差异有显著性。CD59mAb、CD46mAb联合作用于T细胞,Ⅰ组细胞的增殖能力,ZAP-70磷酸化条带的灰度值明显高于Ⅲ、Ⅳ组,差异有显著性(P0.05),,其中Ⅱ组低于Ⅲ组(P0.05),差异有显著性,但Ⅰ、Ⅱ组之间比较(P0.05),差异无统计学意义。 结论：成功构建了重组质粒PSUPER-siCD46;分别建立了稳定转染重组质粒pSUPER-siCD59、 pSUPER-siCD46的Jurkat细胞真核表达系统；RT-PCR实验从mRNA水平证明重组质粒PSUPER-siCD59和pSUPER-siCD46可分别特异性地沉默CD59基因和CD46基因；通过MTT、 Western Blot实验证实,在CD59与CD46的共同作用下,Jurkat细胞的增殖、ZAP-70的磷酸化显著增强,由此证明CD59、CD46在T细胞信号转导过程中存在协同作用。该研究创新之处在于,为跨膜蛋白CD46在GPI锚固蛋白CD59的T细胞跨膜信号转导中的作用提供了实验依据,为T细胞白血病的基因靶向治疗开辟了一条新的途径,具有重要的理论意义及广阔的临床应用前景。
[Abstract]:Aim: to construct pSUPER-siCD46 recombinant plasmid by using siRNA technique, and to observe the effect of CD46 and CD59 specific silencing on T cell signal transduction. The purpose of this study was to investigate the synergistic effect of CD59 and CD46 in T cell signal transduction. Methods: pSUPER-siCD46 recombinant plasmid was constructed and identified by double digestion of PCR, plasmid and DNA sequencing. Jurkat cells were transfected with cationic liposome. The cells were divided into untransfected Jurkat cells (group 鈪，

本文编号：2391023