NGAL特异性核酸适配子的筛选及初步应用

发布时间：2024-07-08 20:40

　　目的:中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)是早期诊断和预测急性肾损伤(AKI)的标志物,而且调控多种肿瘤的发生发展。但目前针对NAGL的检测项目并未在临床上广泛开展,也没有以NGAL为靶点蛋白研发的抗肿瘤药物。核酸适配子是一类高特异性高亲和力结合靶标的单链DNA或RNA,在诊断和治疗中广泛应用。本研究拟通过磁珠SELEX,筛选与NGAL高特异性高亲和力结合的核酸适配子,一方面用于建立可广泛推广、简便低廉用于临床诊断的酶联适配子分析(ELAA)检测方法;另一方面,初步探索NGAL特异性核酸适配子能否调节肿瘤细胞的恶性增殖,为抗肿瘤药物研发提供一个新思路。方法:(1)通过磁珠SELEX筛选NGAL特异性核酸适配子,生物信息学方法对适配子进行序列同源性分析和二级结构预测,qPCR法验证比较候选适配子及适配子对NGAL的特异性和亲和力。(2)选取最优适配子A53替换ELISA中的第二个抗体,建立ELAA检测方法,并进行性能评价,包括特异性、线性范围、灵敏度、精密度、准确性及临床样本检测。(3)通过免疫荧光验证A53与食管鳞癌细胞KYSE45表达的NGAL的特异性结合,克隆形成实验和CC...

【文章页数】：72 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１磁珠ＳＥＬＥＸ筛选策略??

（２）磁珠ＳＥＬＥＸ筛选ＮＧＡＬ特异性适配子策略：??本研究的筛选策略是采用蛋白筛选中较为经典成熟的磁珠ＳＥＬＥＸ来筛选??靶标ＮＧＡＬ的特异性核酸适配子。具体策略如图１：①包被ＮＧＡＬ的磁珠与??ｓｓＤＮＡ库孵育进行ＳＥＬＥＸ筛选，并从第三轮开始在每轮筛选之前加入裸磁珠??进行....

图２?ＥＬＡＡ检测策略??

或多个适配子及待测靶标形成三明治夹心结构的分析模式，其原理与ＥＬ１ＳＡ相??似。本研宄用ＮＧＡＬ最优适配子Ａ５３替代ＥＬ１ＳＡ中的第二个抗体建立了?ＥＬＡＡ??检测方法，具体检测策略如图２：①将ＮＧＡＬ抗体包被于９６孔板上，用３％?ＢＳＡ??封闭；②加入ＮＧＡＬ溶液孵育洗涤；③加....

图3，Sllt的DNA库

第二章材料和方法第二章材料和方法??材料??单链ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）库的设计和合成??用两端各为２０ｎｔ的固定的引物互补序列，中间为３５５ｎｔ的封闭型的ｓｓＤＮＡ库（图３），库容量大约１０２１，：??ＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧ－Ｎ３５－ＣＣＴＡＴＧＣＧＴＧＣＴＡＣＣＧ－Ｎ－Ｎ?Ｎ....

图４?ＮＧＡＬ验证及包被结果??Ａ，考马斯亮蓝染色验证ＮＧＡＬ纯度；Ｂ，?ＢＣＡ法测定蛋白包被前后上清溶液蛋白浓度，ｔ??

干粉加入５００叫ｄｄｗ溶解后，用Ｐｉｅｒｃｅ？?ＢＣＡ?Ｐｒｏｔｅｉｎ?Ａｓｓａｙ?Ｋｉｔ测其浓度为??１．０６明／叫与说明书一致。取ｌＯ＾ＬＮＧＡＬ经１２％?ＳＤＳ?ＰＡＧＥ胶电泳后考马斯亮蓝??染色，结果如图４Ａ，位于２５ｋＤ左右显示明亮清晰的ＮＧＡＬ条带，条带大小与说??明....

本文编号：4003847