P53抑制剂诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

发布时间：2018-12-27 15:19

【摘要】：研究背景 近年来冠心病(Coronary Heart Disease, CHD)发病率逐年增加,特别是心肌梗死(Myocaridal Infarction, MI)等导致的缺血性心肌病(Ischemic Cardiomyopathy, ICM)已成为影响人类健康的主要疾病之一。最近研究表明心肌梗死后也有少量的心肌细胞发生分裂增殖,但是分裂增殖的细胞数量偏少,每年1%更新率不足以弥补心肌梗死时大量心肌细胞的坏死。因此心肌梗死引起的大量心肌细胞坏死最终导致缺血性心肌病的发生,引发严重心力衰竭和各种心血管并发症,五年死亡率高达45%左右。尽管冠心病的药物治疗、外科搭桥技术和介入治疗技术不断提高,但是死亡率仍居高不下。因此心肌梗死后,如何修复坏死心肌细胞一直是科研人员和临床医师面临的严峻挑战。近年来干细胞移植治疗为缺血性心肌病患者带来新的曙光,目前骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMMSCs)移植治疗心肌梗死的研究已取得令人鼓舞的进展,但如何诱导BMMSCs获得足够数量的心肌样细胞成为研究的难点和热点之一。随着研究的深入,在不久的将来将逐步解决在心肌梗死后缺血性心肌病的BMMSCs移植治疗过程中出现的各种问题,并获得显著疗效。 研究目的 1.探讨大鼠BMMSCs体外分离、纯化、传代及鉴定方法。 2.观察PFT-α对大鼠BMMSCs增殖和凋亡的影响及可能机制。 3.探索PFT-α对大鼠BMMSCs向心肌样细胞诱导分化的影响路径及其可能机制。 研究方法 1.大鼠BMMSCs体外分离、纯化及鉴定:采用颈椎脱臼法处死大鼠后分离下肢长骨,将获取的骨髓细胞通过密度梯度离心法联合差速贴壁法去除BMMSCs中混杂的其他细胞,获得纯化的BMMSCs。倒置相差显微镜下观察BMMSCs在培养传代过程中细胞形态学变化,联合流式细胞仪检测BMMSCs阳性表面标记抗原CD44和阴性标记抗原CD45进行细胞鉴定。 2. PFT-α对大鼠BMMSCs增殖和凋亡的影响:取第4代BMMSCs,采用MTT法检测PFT-α的细胞毒性。同时进行分组处理:空白对照组(CON)、5-AZA组(10μmol/L)、PFT-α组(20μmol/L)、5-AZA+PFT-α组(10μmol/L+20μmol/L)。MTT法检测PFT-α对BMMSCs增殖的影响,流式细胞仪检测PFT-α对BMMSCs凋亡的影响,Western Blotting法检测P53、P21蛋白的表达。 3. PFT-α诱导BMMSCs分化为心肌样细胞:取第4代BMMSCs进行分组诱导,空白对照组(CON)、5-AZA组(10μmol/L)、PFT-α组(20μmol/L)、5-AZA+PFT-α组(10μmol/L+20μmol/L)。各组诱导24 h后更换常规培养液继续培养4 w。显微镜下观察不同时间点细胞形态学变化,免疫荧光染色法鉴定各组BMMSCs诱导后1 w、4 w时心肌肌钙蛋白I (cTn I)和链接蛋白-43(CX-43)的表达;Western Blotting法检测cTn I、P53、P21蛋白的表达;流式细胞仪检测心肌样细胞分化率。 研究结果 1.大鼠BMMSCs体外培养形态特征及鉴定:原代BMMSCs体积较小,形态多样,大部分细胞为椭圆形、短梭形,7 d后细胞体积增大,以长梭形为主,形成细胞集落。传代后细胞呈长梭形、旋涡状生长,且排列紧密、形态均一、趋向一致。流式细胞仪检测BMMSCs表面标志抗原CD44和CD45,结果显示:CD44阳性表达率为(89.98±1.29)%,CD45阳性表达率为(2.14±0.22)%。 2. PFT-α对大鼠BMMSCs增殖和凋亡的影响:MTT法检测不同浓度PFT-α的细胞毒性,结果显示:当PFT-α浓度等于或者低于20μmol/L时,对BMMSCs的增殖有一定促进作用,而当其浓度达到40μmol/L时,PFT-α则可明显抑制BMMSCs的增殖,当浓度达到80μmol/L时,PFT-α显著抑制BMMSCs细胞的增殖;MTT法检测PFT-α对BMMSCs增殖的影响,结果显示:BMMSCs在处理后前3 d,各组细胞增殖没有明显差异,在第5 d时,5-AZA组对BMMSCs增殖表现出明显抑制,与CON组、PFT-α组及5-AZA+PFT-α组比较有显著统计学差异(P0.01),在第7 d时,也同样表现出这样的差异(P0.01),并且PFT-α组和5-AZA+PFT-α组BMMSCs增殖明显优于空白对照组(P0.01);流式细胞仪检测各组BMMSCs凋亡率,结果显示:5-AZA组细胞凋亡率最高,与CON组、PFT-α组及5-AZA+PFT-α组比较有显著统计学差异(P0.01),其余3组无统计学差异(P0.05);Western blotting法测定P53、P21蛋白表达,结果显示:5-AZA组表达量明显强于其余3组,与CON组、PFT-α组、5-AZA+PFT-α组比较有显著统计学差异(P0.001);而PFT-α组P53、P21蛋白表达量明显减少,与CON组和5-AZA+PFT-α组比较有统计学差异(P0.01),CON组和5-AZA+PFT-α组比较无统计学差异(P0.05)。 3. PFT-α诱导BMMSCs分化为心肌样细胞的鉴定:各组BMMSCs诱导后细胞形态学变化:除CON组外,各组细胞诱导约2 w后,开始出现细胞体积及核增大,大部分细胞变为长梭状。诱导4 w时邻近细胞间连接较前紧密,并形成肌节样结构;免疫荧光染色鉴定结果:诱导后1 w时CON组未见cTn I和CX-43免疫荧光表达,其余3组均可见少量表达。诱导后4 w时可见CON组少量表达cTn I和CX-43,其余3组均强表达cTn I和CX-43,并可见肌管样结构;Western Blotting检测cTn I的表达,1 w时CON组未见表达cTn I,其余3组均有少量表达。4 w时,CON组可见少量表达,其余3组均有强表达。各组cTn I表达在4 w时均明显高于1 w时的表达;流式细胞仪检测心肌样细胞的分化率,结果显示:CON组分化率为(2.34±0.91)%,5-AZA组为(21.47±5.41)%,PFT-α组为(29.85±1.96)%,5-AZA+PFT-α组为(30.97±5.74)%,5-AZA组、PFT-α组和5-AZA+PFT-α组与CON组比较均有显著统计学差异(P0.01),PFT-α组、5-AZA+PFT-α组与5-AZA组比较均有显著统计学差异(P 0.01) , PFT-α组和5-AZA+PFT-α组无明显统计学差异(P0.05);Western Blotting检测P53、P21蛋白表达,结果显示:诱导1 w时,5-AZA组P53、P21表达最强,PFT-α组几乎不表达,5-AZA组与其余3组比较均有显著统计学差异(P0.01),PFT-α和5-AZA+PFT-α组间无统计学差异(P0.05)。诱导4 w时,5-AZA组仍强表达,其余3组表达较1 w时有所增强,5-AZA组、PFT-α组、混合组与CON组比较均有统计学差异(P0.05),5-AZA组与PFT-α组比较有显著统计学差异(P0.01)。PFT-α组、混合组组内诱导4 w时P53、P21表达量与1 w时比较均有统计学差异(P0.05)。 研究结论 1.采用密度梯度离心法联合差速贴壁法能够获得纯化的BMMSCs,通过观察BMMSCs形态学特征和检测BMMSCs阳性标记抗原CD44和阴性标记抗原CD45,可以鉴定纯化的BMMSCs。 2. PFT-α可以促进BMMSCs的增殖,抑制BMMSCs的凋亡。当PFT-α浓度≤20μmol/L时,对BMMSCs无毒性作用,能够促进BMMSCs增殖,抑制BMMSCs凋亡。当浓度20μmol/L时则抑制细胞增殖,具有细胞毒性。 3. PFT-α能够诱导BMMSCs向心肌样细胞分化,且分化率比5-AZA组提高了39%,具有显著性差异(P0.01)。 4. PFT-α可能是通过抑制P53,阻断P53-P21蛋白通路抑制细胞凋亡,促进细胞增殖,并诱导BMMSCs向心肌样细胞分化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R329

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 朱勇;陈良万;林若柏;韩子阳;康明强;;SD大鼠骨髓间充质干细胞体外培养、表型鉴定及标记[J];吉林大学学报(医学版);2009年02期

2 陈嘉;孙京臣;邹移海;张进;黄冰;;丹酚酸B诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化[J];第四军医大学学报;2007年23期

3 倪玉霞;李澎;李贻奎;束云;;大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定[J];广西医科大学学报;2009年01期

4 程芮;王士雯;曹丰;张友荣;徐勇;孟玲;王韫芳;李艳华;卢才义;裴雪涛;;应用自制心内膜注射导管移植自体骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死[J];中华老年心脑血管病杂志;2005年06期

5 李志泉;冼绍祥;汪朝晖;杨忠奇;;三七总皂苷对骨髓间充质干细胞增殖和向心肌样细胞分化的影响[J];广州中医药大学学报;2007年06期

6 史剑慧,胡昕婴,牛玉宏,葛均波;二甲亚砜诱导人骨髓基质干细胞心肌分化中的基因表达[J];复旦学报(医学版);2004年05期

7 邢玉洁;吕安林;王利;燕学波;;聚乳酸-聚乙醇酸共聚物复合心肌样细胞体外构建工程化心肌组织[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年16期

8 杜娟娟;陶凌;周祥;张英梅;邢玉洁;王利;赵晓梅;吕安林;;移植心肌样细胞对心肌梗死后功能性室壁瘤大鼠心功能的影响[J];心脏杂志;2009年02期

9 何庚戌;要彤;张浩;胡盛寿;张晓玲;魏英杰;;骨髓间充质干细胞经静脉移植到心肌梗死大鼠体内后的分布[J];心脏杂志;2009年02期

10 庞永刚,陈文弦,崔鹏程;人骨髓间质干细胞的优化培养[J];中国修复重建外科杂志;2004年03期

，

本文编号：2393264