同源盒基因HOXA4转染人脐带间充质干细胞体外诱导表皮细胞的实验研究

发布时间：2018-12-29 13:29

【摘要】：目的：本课题旨在构建携带同源基因HOXA4的慢病毒表达载体，体外观察转染HOXA4基因后的人脐带间充质干细胞（human umbilicalcord mesenchymal stemcells hUCMSCs）的生物学特性及定向分化为表皮细胞的能力。为皮肤缺损及烧伤疾病的细胞治疗及基因治疗提供实验依据。方法： 1、使用酶切及PCR技术从克隆模版HOXA4－MSCV逆转录载体中获取目的基因HOXA4，并将HOXA4基因重组到慢病毒载体表达质粒plenti-GFP-CTB上，通过酶切、测序验证HOXA4基因序列无误后，将plenti-GFP-HOXA4质粒、辅助包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE、PMD2G共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞，获得携带HOXA4基因的重组慢病毒Lentil-GFP-HOXA4。 2、将获取的慢病毒液感染hUCMSCs48h后，在荧光显微镜下观察慢病毒感染后的细胞形态改变、绿色荧光表达（GFP）强弱，流式细胞术检测其GFP表达效率。利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法在基因水平上检测HOXA4在hUCMSCs中的表达情况。流式细胞术检测转基因hUCMSCs细胞周期。 3、在体外培养条件下，不添加任何诱导因子，将HOXA4基因修饰的hUCMSCs培养诱导分化21d,细胞免疫组化检测特异性表皮细胞分子标志CK18、CK19、人广谱角蛋白的表达情况，流式细胞术检测CK14、CK18的表达情况。结果： 1.应用PCR技术对含有HOXA4的质粒模版进行扩增，成功获取了HOXA4基因，Plenti-GFP-载体成功酶切线性化。细菌阳性克隆经PCR鉴定证明，重组质粒plenti-GFP-HOXA4构建成功并能在感受态大肠杆菌中大量扩增；测序结果显示，plenti-GFP-HOXA4中HOXA4与质粒克隆模版中序列完全一致。慢病毒载体plenti-GFP-HOXA4转染293T细胞，72h后应用RT-PCR检测结果显示，在接近1kb处观察到有目的条带（目的条带为936bp），显示HOXA4基因表达。在荧光显微镜下可观察到通过慢病毒载体系统共转染的293T细胞中有绿色荧光蛋白的表达，说明病毒包装成功。应用流式细胞术测定plenti-GFP-HOXA4的病毒滴度为2.11×108TU/ml。 2.基因转染hUCMSCs48h后观察到较强的绿色荧光表达，当病毒感染复数（muhiplicities of infection MOI）值为60时pLenti-GFP-HOXA4及pLenti-GFP的转染率均达到90%以上，RT-PCR检测到目的基因HOXA4在hUCMSCs中表达。流式细胞术检测示80%以上转染基因的hUCMSCs处于G0和G1期，增殖能力未受明显影响。 3.将HOXA4基因修饰的hUCMSCs在单层培养条件下，体外诱导7d后，少量细胞形态发生改变，由长梭性变为不规则形，细胞内颗粒增多。到14d细胞形态改变更明显，，呈聚集生长，并出现多个突起，在21d左右，通过流式细胞仪及免疫组化测到角蛋白14、19，18、人广谱角蛋白均有表达，与未转染基因的hUCMSCs比较阳性细胞比率明显增多，说明转染HOXA4基因不影响hUCMSCs的体外活性且转基因的hUCMSCs在体外一定条件下可以向表皮细胞分化。结论： 1、HOXA4基因慢病毒载体构建成功。 2、hUCMSCs在体外易于被外源基因修饰，且对其增殖分化无影响。 3、在体外不添加生长因子及其他诱导因子培养条件下，转染了HOXA4基因的hUCMSCs具有较强的向表皮细胞分化的能力，表明HOXA4基因在调控表皮细胞分化过程中发挥了重要作用。
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【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329

【参考文献】