博尔纳病病毒对人少突胶质细胞增殖与凋亡影响的初步研究

发布时间：2018-12-30 21:25

【摘要】：背景及目的：博尔纳病病毒(Borna disease virus，BDV)是一种非细胞毒性的、单股负链的RNA病毒，具有高度嗜神经细胞特性，能引起中枢神经系统持续病毒感染, BDV宿主范围很广，据报道可引起鼠、马、兔、狗等多种温血类动物的自然感染或实验室感染，并表现出以明显的精神、行为异常等为特征的神经精神临床症状。同时，大量国内外的的流行病学调查显示BDV感染可能与人类某些精神神经疾病的发生有一定联系,BDV能感染神经元和神经胶质细胞，引起神经细胞可塑性、代谢分泌功能改变，但感染具体机制研究国内外报道较少，其中BDV对神经胶质细胞的感染机制研究更为少见。本研究通过BDV实验感染人少突胶质细胞（oligodendrocyte cells，，OL cells），针对血清浓度单因素改变对BDV病毒滴度结果的影响进行比较，探讨选择BDV感染细胞适宜的血清浓度，以进一步开展BDV感染神经细胞研究，另一方面在最适宜血清浓度培养条件下用病毒感染细胞，观察其对OL细胞的增殖生长和凋亡的影响，并探讨病毒致病相关分子机制。方法： 1复苏OL/BDV3660株细胞，通过反复冻融方式获取病毒液。将OL细胞在含不同浓度FBS的DMEM液条件下进行培养，同时制备不同稀释倍数的病毒液，依次用不同稀释浓度的病毒液感染细胞，常规培养7日后，通过免疫组化方法检测病毒阳性细胞集落数，计算出最适合该病毒感染少突胶质细胞的血清浓度。 2培养OL细胞，加入BDV病毒液感染OL细胞，通过BDV核蛋白免疫荧光实验鉴定BDV感染是否成功，以建立BDV感染的OL细胞模型。 3采用CCK8试剂盒，分别测定BDV感染OL细胞1~7天的生长增殖情况，绘制生长曲线。同时采用流式细胞技术测定BDV感染OL细胞24内不同时间点，细胞周期各期的DNA含量，观察感染对增殖能力的影响。收集BDV感染1、3、5天的OL细胞，采用流式细胞技术，测定凋亡细胞数目。 4培养细胞，分别提取BDV感染1、3、5天的OL细胞蛋白，采用Western-blot方法检测凋亡相关指标Bcl-2、Bax的蛋白相对表达量变化。结果： 1病毒滴度测定后显示，在2%FBS培养条件下，病毒滴度测定值相比其它几种培养条件更高。 2通过免疫荧光鉴定发现，BDV感染OL细胞3天和5天时，均可发现P40蛋白绿色荧光表达，说明BDV感染OL细胞成功。 3通过CCK8试剂盒测定OL细胞增殖能力发现，BDV感染细胞7天内，随着时间的增加，细胞的数量逐渐增多。但与对照组OL细胞相比，感染组细胞的增殖能力明显更低（P㩳0.05）。 4采用流式细胞技术测定BDV感染OL细胞24小时内的周期变化发现，感染细胞周期G2期延迟，细胞增殖指数降低。采用流式细胞技术测定凋亡细胞数目发现，在BDV感染OL细胞3天和5天时，感染组检测到的凋亡细胞数明显多于对照组细胞（P㩳0.05）。 5采用Western-blot免疫印迹方法检测凋亡相关标志物Bcl-2、Bax的蛋白相对表达量发现，在感染3天和感染5天时，感染组细胞的促凋亡标志Bax的蛋白表达量明显高于对照组细胞；而感染组细胞抑凋亡标志Bcl-2的蛋白表达量明显低于对照组（P㩳0.05）。结论： 1不同浓度血清的病毒培养条件可影响BDV对细胞的感染力，2%FBS的培养条件可能更适合于BDV感染OL细胞实验。 2BDV感染可以抑制OL细胞增殖生长，并可能通过上调Bax蛋白和下调Bcl-2蛋白的相对表达量，从而参与诱导细胞凋亡的发生。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R363

【参考文献】