【摘要】：一、研究目的和意义 人树突状细胞(hDCs)是专职的抗原提呈细胞,通过其表面的MHC类分子与肽类抗原结合,将抗原呈递给T细胞,促进T细胞的活化和增殖,另外,还可促进B细胞的活化和调节体液免疫。成熟DC的表面高表达MHC类分子、黏附分子、细胞因子(如IL-12)等的分泌,很大程度上促进了机体的免疫应答反应,DC的这种特性被广泛应用于抗肿瘤免疫治疗和抗感染治疗等。以DC成熟为基础的免疫应答虽然能有效的突破细胞水平的自身免疫耐受并活化自身抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞,却很少引起抗瘤和正常组织的自身免疫病理反应,高亲和性自身抗原肽、促进树突状细胞成熟及TLR效应剂活化高效的自身反应性T细胞反应却并不足以打破属主的自身耐受诱导自身抗肿瘤免疫病理。说明突破细胞水平(自身反应性CTL活化)及宿主水平(自身免疫病理)的自身耐受条件是不同的,即使在炎症刺激持续存在的条件下,强有力的信号抑制子也能有效阻止DC过度活化自身反应性CTL引起自身免疫病理,在自然状态抑制机体免疫的条件下宿主水平的自身免疫耐受依然存在,并可能由各种机制持续促进,例如,调节性T细胞及肿瘤的各种诱导因子等,这样就阻碍了以DC为基础的瘤苗的效率及运用。Gilboa E等已经证明鼠的树突状细胞可以诱导有效的抗肿瘤应答,但是目前针对肿瘤患者的DC疫苗的试验客观临床反应率很低,结果令人不满意。所以找到针对肿瘤抗原可以诱导产生有效的抗肿瘤免疫应答的途径是DC疫苗的一大挑战。 SOCS家族通过JAK-STAT (Janus kinase signal transduction and activators of transcription)细胞信号传导通路调节细胞因子的分泌,SOCS家族由SOCS1-SOCS7及CIS (cytokine-inducible SH2-containing protein)8个成员组成,它们共同拥有一个中央SH2域和高度保守的羧基端SOCS盒。SOCS1是最早发现的细胞因子信号传导抑制因子,SOCS1的调节功能的分子机制是利用基因敲除鼠和基因沉默技术逐步发现的。作为负反馈调节因子之一,SOCS1通过直接抑制JAK酪氨酸激酶和活性细胞因子的级联信号来下调细胞因子信号传导。同时,某些研究发现SOCS1还可以通过直接或间接的机制下调TLR(Toll-like receptor, Toll样受体)信号传导通路。细胞因子受体传导通路和TLR信号传导通路对许多种类的细胞的生存、成熟和分化和免疫功能等重要功能都起着重要的调节作用。SOCS1已经在多种人类恶性肿瘤细胞中被检测出异常表达,进而导致了细胞因子受体和TLR受体促进细胞转化的信号传导调节异常。SOCS1还被发现与肿瘤细胞的致癌作用有关。对于抗原提呈细胞(antigens presenting cells, APCs)来说,SOCS1被大家认为是经典的抗原提呈衰减子,SOCS1负性调节APC分泌的细胞因子的信号传导,以此来影响微环境中APCs和T细胞的功能和分化。SOCS1通过负反馈机制调控许多细胞因子的信号传导,如IFN-Υ、IFN-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21等。而这些细胞因子对人体的免疫应答起着至关重要的作用,例如IL-2促进CD4＋T淋巴细胞的产生,IL-7对CD8＋T淋巴细胞的存活和维持CD4＋T淋巴细胞的内稳态起着重要作用,IL-12通过增加CD8＋T淋巴细胞对IL-7、IL-15的敏感性来调控CD8＋T淋巴细胞的免疫应答效应等等。SOCS1还通过一些机制直接影响T细胞的的分化、成熟和功能。正因为在免疫调节机制方面的重要地位,SOCS1已经在某些免疫相关疾病中得到广泛研究,如恶性肿瘤、HIV感染、系统性红斑狼疮(SLE)、风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)等等。因此通过沉默SOCS1导致抗原呈递DCs的IL-12信号和下游细胞因子网络不受约束,从而导致宿主水平自身耐受的打破,有望成为肿瘤疫苗治疗的新方向。Hong B等已经通过体外及体内实验证实沉默树突状细胞SOCS1基因可以增强特异性抗肿瘤免疫。因此,我们希望利用构建慢病毒载体SOCS1基因siRNA,抑制树突状细胞中SOCS1基因的表达,为下一步研究沉默树突状细胞SOCS1基因的DC疫苗提供一种技术方法。目前已有化学合成方法制备小干扰RNA(siRNA)抑制人树突状细胞SOCS1基因,从而进一步研究hDC免疫功能改变,但siRNA不稳定,抑制时间较短,抑制效率较低,本实验拟通过构建慢病毒重组质粒,长时间抑制SOCS1基因,且抑制效率较高,为进一步研究DC增强抗肿瘤免疫应答效应奠定基础。 二、方法 1.人SOCS1寡核苷酸的设计与合成查阅与本课题类似的相关文献,据其筛选出一条序列作为RNAi靶点,送吉玛公司设计、合成寡核苷酸链,其中正义链的5’末端引入Bbs I酶切位点,反义链的5’末端引入Xho I酶切位点。序列如下：SOCS15'-CACGCACTTCCGCACATTC-3';设计阴性对照为Negative:5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。 2.人SOCS1siRNA表达重组体的构建将合成的寡核苷酸链5’端磷酸化,退火形成具有Bbs I、Xho I酶切位点的双链DNA,与已经进行过酶切处理的慢病毒载体LV1连接,构建人SOCS1siRNA慢病毒干扰载体质粒。利用感受态的大肠杆菌DH5a转化重组质粒,PCR扩增进行初步鉴定,然后用质粒试剂盒抽提质粒,并通过DNA测序进一步鉴定。 3.病毒生产及包装正常培养293T细胞,在感染前一天接种到培养皿中继续培养。SOCS1-siRNA慢病毒包装复合物共转染293T细胞,用含10%胎牛血清的DMEM在转染后24h换液；转染后48h,收集细胞上清,5000r/min离心5min,然后使用0.45μm的聚偏氟乙烯膜过滤上清液,放在-80℃冰箱保存。 4.病毒的滴度测定正常培养293T细胞,在感染前一天接种到96孔板中继续培养。使用已经生产好的病毒液感染293T细胞,72h后用荧光显微镜观察并计数荧光细胞,结合稀释倍数计算病毒滴度。 5.DC培养抽取健康成年志愿者外周血经等量生理盐水稀释后Ficoll分离,收集淋巴细胞,以AIM-V为培养基,调节细胞浓度为5×105/ml,培养于6孔板,每孔3m1,在37℃、5%C02孵箱中培养贴壁5h后轻轻洗去悬浮的淋巴细胞,每孔加3m1含GM-CSF(终浓度为800U/m1)的AIM-V培养基。隔天换液,每孔加入3ml含GM-CSF(终浓度为800U/m1)、IL-4(终浓度为800U/m1)的AIM-V培养基。第5天,除了GM-CSF和IL-4外,还加入TNF-α(终浓度为20ng/m1)。第7天,收集DC,光学显微镜下观察DC形态。 6.基因转染DC培养第3天进行病毒转染。转染实验共分为3组：(1)空白细胞组；(2)siRNA-Negative组；(3)siRNA组。其中空白细胞组作为对照组,用于检测树突状细胞中SOCS1基因的本底表达量；siRNA-Negative组用于检测阴性序列质粒本身转染入细胞中是否影响SOCS1基因的表达量。6孔板每组2孔,干扰组每孔分别加入40μ1稀释至106病毒液及终浓度为5μg/ml的Polybrene,阴性对照组加入对照病毒液40μ1及终浓度为5μg/ml的Polybrene,空白对照组加入相同量的AIM-V培养基,每孔加入960μ1含GM-CSF(终浓度为800U/m1)及IL-4(终浓度为800U/m1)的AIM-V培养基。培养12h后换液,每孔加3m1含GM-CSF(终浓度为800U/m1)及IL-4(终浓度为800U/m1)的AIM-V培养基。然后隔天换液。 7.实时荧光定量PCR检测SOCS1mRNA的表达DCs慢病毒干扰96h后利用荧光显微镜观察转染后树突状细胞的荧光表达情况。 8.Western blot检测DCs细胞SOCS1蛋白的表达siRNA干扰96小时后分别收集三组hDCs, RIPA全细胞裂解液提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白质浓度。各取30μg上述蛋白样品进行8%SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭、抗SOCS1抗体4℃孵育、TBST洗膜3次、HRP标记的二抗作用、再次TBST洗膜3次后化学发光法显影,X光片曝光显影,凝胶成像分析系统摄像分析。 9.统计学处理我们利用SPSS13.0软件分析实验结果,计量资料以均数±标准差(-X±S)表示。RT-PCR和Western Blot的实验数据均采用方差分析(one-way AN OVA)比较各个实验组之间的差异,设定检验水准a=0.05。 三、结果 1.DC形态学观察光学显微镜下可见,培养7天中,从外周血分离获得的大量成熟DC细胞,细胞形态不一,长短不一的树突状突起逐渐长出,各个DC细胞之间构成集落。 2.荧光显微镜观察转染效率SOCS1siRNA慢病毒载体感染树突状细胞48h、96h后分别用荧光显微镜观察病毒转染效率。96h后染上绿色荧光树突状细胞较48h明显增多,肉眼所见染色细胞在70%以上,初步表明慢病毒载体构建成功。 3.RT-PCR检测hDCs SOCS1mRNA表达情况实时荧光定量PCR结果显示,与空白细胞组及阴性对照组比较,siRNA组mRNA表达量下调达72%。SOCS1基因和GAPDH基因PCR产物的融解曲线,证实PCR产物为特异扩增产物,用其定量准确可信。 4.Western blot检测DCs SOCS1蛋白的表达情况Western blot检测与空白细胞组及阴性对照组相比,siRNA组SOCS1蛋白的表达显著降低(P0.05) 四、结论 我们利用慢病毒载体构建的SOCS1基因siRNA可以成功转染树突状细胞,siRNA干扰细胞较正常细胞比,SOCS1的表达明显降低。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R392
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本文编号：2410769
